Μελέτη της δράσης του υδροθείου στη διαφοροποίηση και τις λειτουργίες των λιποκυττάρων

• Κύριος συγγραφέας: Μαλάκης, Χαρίλαος
• Άλλοι συγγραφείς: Τοπούζης, Σταύρος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2017
• Θέματα: Λιποκύτταρα; Διαφοροποίηση; Ρεζιστίνη; Αγγειοτενσινογόνο; Υδρόθειο; Λιπόλυση; Πρόσληψη γλυκόζης; Μεταβολικό σύνδρομο; Adipocytes; Differentiation; Resistin; Angiotensinogen; UCP1; Hydrogen sulfide; Lipolysis; Glucose uptake; Metabolic syndrome; 3T3-L1; 571.945 71

Η λειτουργία του λιπώδους ιστού, είτε πρόκειται για το “λευκό” είτε για το “φαιό” λίπος, είναι ένας καθοριστικός παράγοντας στην ανάπτυξη και εξέλιξη σημαντικού αριθμού ασθενειών και νοσημάτων (πχ διαβήτης, αθηροσκλήρωση), όπου ο ιστός αυτός συνεισφέρει σημαντικά μέσω χαρακτηριστικών μεταβολικών, ενδοκρινικών, και φλεγμονωδών διεργασιών του. Γι’ αυτόν το λόγο, αποφασίσαμε να μελετήσουμε την επίδραση του υδροθείου (H2S), ενός νέου ενδογενούς σηματοδοτικού μορίου με προταθέντα ρόλο στην κυτταρική ενεργειακή ομοιόσταση, στη διαφοροποίηση και λειτουργικότητα των λιποκυττάρων, χρησιμοποιώντας in vitro κυτταρικές καλλιέργειες πρόδρομων κυττάρων 3T3-L1 και T37i (που προέρχονται από ποντίκια) οι οποίες διαφοροποιήθηκαν προς ώριμα “λευκά”, “μπεζ” (3T3-L1) και “φαιά”(Τ37i) λιποκύτταρα. Τα “μπεζ” λιποκύτταρα προσομοιάζουν σε χαρακτηριστικά τα “φαιά” λιποκύτταρα που έχουν περιγραφεί in vivo. Προς αυτή την κατεύθυνση, θέσαμε τα κάτωθι τρία βασικά ερωτήματα: 1. Πώς εκφράζονται τα τρία ένζυμα παραγωγής του ενδογενούς H2S, η β-συνθετάση της κυσταθειονίνης (CBS), η γ-λυάση της κυσταθειονίνης (CSE) και η αμινομεταφοράση του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού (3-MST), κατά τη διαφοροποίηση πρόδρομων κυττάρων προς ώριμα λιποκύτταρα; 2. Πώς επηρεάζει η παρουσία εξωγενούς H2S ή η αναστολή παραγωγής ενδογενούς H2S, τη διαφοροποίηση πρόδρομων κυττάρων σε ώριμα λιποκύτταρα; 3. Πώς επηρεάζει η παρουσία εξωγενούς H2S (Na2S 30μM) ή η αναστολή παραγωγής ενδογενούς H2S κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης (με τη χρήση αναστολέα του ΑΟΑΑ 0,5mM), χαρακτηριστικές λειτουργίες των “ώριμων” λιποκυττάρων, όπως η πρόσληψη γλυκόζης και η λιπόλυση; Ανάλυση της έκφρασης των τριών ενζύμων παραγωγής H2S σε επίπεδο mRNA με real-time RT-PCR και ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών κατά Western σε κύτταρα 3T3-L1 έδειξε ότι: α) διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους ως προς την έκφραση κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, π.χ. το 139 ένζυμο CSE εκφράζεται υψηλότερα κατά την έναρξη της διαφοροποίησης των “λευκών” λιποκυττάρων (ημέρα 3), ενώ το ένζυμο CBS στα ώριμα “λευκά” λιποκύτταρα (ημέρα 8), β) η έκφραση του ίδιου ενζύμου είναι διαφορετική στους δύο τύπους λιποκυττάρων, π.χ. η έκφραση του 3-MST παραμένει σταθερή καθ’ όλη τη διάρκεια διαφοροποίησης προς “λευκό” λίπος, ενώ ανέρχεται 15 φορές κατά τη διαφοροποίηση προς “μπεζ” λίπος, γ) σε όλα τα στάδια της διαφοροποίησης, είτε προς “λευκά” είτε προς “μπεζ” λιποκύτταρα, υπάρχει συνδυασμός έκφρασης των ενζύμων παραγωγής του H2S, και άρα δ) έχει νόημα η χρήση φαρμακολογικού αναστολέα της παραγωγής H2S (ΑΟΑΑ, αναστολέας των CSE και CBS) κατά τη διαφοροποίηση, ώστε να εξετάσουμε τον ρόλο του ενδογενούς H2S σε αυτήν τη διαδικασία και στα ώριμα λιποκύτταρα. Σε κύτταρα 3T3-L1 έγινε ανάλυση της έκφρασης χαρακτηριστικών γονιδίων, για κάθε τύπο λιποκυττάρων, σε επίπεδο mRNA με τεχνική real-time RT-PCR. Η παρουσία του δότη H2S, του μορίου Na2S ή του αναστολέα παραγωγής του, του ΑΟΑΑ, κατά τη διαφοροποίηση πρoς ώριμα “λευκά” λιποκύτταρα, τροποποιεί δραστικά την έκφραση των δεικτών διαφοροποίησης Σερπίνης Α3k και Αγγειοτενσινογόνου. Η πλέον ενδιαφέρουσα παρατήρηση είναι ότι το Na2S μειώνει κατά ~90% την έκφραση της Ρεζιστίνης, μορίου που έχει συνδεθεί με την ανάπτυξη μεταβολικού συνδρόμου σε πειραματόζωα, ενώ αντιθέτως, ο ΑΟΑΑ επάγει την έκφρασή της ~20-φορές. Όταν το Na2S και ο ΑΟΑΑ είναι παρόντες, κατά τη διαφοροποίηση πρoς “μπεζ” λιποκύτταρα, δεν επηρεάζουν την έκφραση του χαρακτηριστικού “συντονιστικού” μεταγραφικού παράγοντα PGC-1α, ενώ και τα δύο μόρια μειώνουν την έκφραση της σημαντικής μιτοχονδριακής πρωτεΐνης UCP1 κατά 25-50%. Στα ώριμα “λευκά” λιποκύτταρα (προερχόμενα από 3T3-L1), η παρουσία του Na2S κατά τη διαφοροποίηση δεν επηρέασε τη βασική λιπόλυση, αλλά μείωσε στατιστικά σημαντικά τη λιπόλυση σε απόκριση στην ισοπροτερενόλη. Σε αντίθεση η παρουσία του ΑΟΑΑ αύξησε σημαντικά την απόκριση στην ισοπροτερενόλη. Στα “μπέζ” λιποκύτταρα, η παρουσία δότη H2S ή αναστολέα παραγωγής του κατά τη διαφοροποίηση δεν επηρέασε τη βασική ή επαγόμενη από την ισοπροτερενόλη λιπόλυση. Η πρόληψη γλυκόζης εξετάστηκε στα κύτταρα T37i από λίπωμα ποντικού, που διαφοροποιήθηκαν προς “φαιά” λιποκύτταρα. Η παρουσία του δότη H2S (Na2S) κατά τη διαφοροποίηση αύξησε και τη βασική, αλλά και την επαγόμενη από ινσουλίνη πρόσληψη 140 γλυκόζης στα διαφοροποιημένα λιποκύτταρα, ενώ ο αναστολέας παραγωγής του H2S, το ΑΟΑΑ, δεν επηρέασε την πρόσληψη υπό βασικές ή επαγόμενες συνθήκες. Από την παρούσα εργασία, συνάγουμε ότι κατά τη διαφοροποίηση προδρόμων λιποκυττάρων προς ώριμα “λευκά”, “μπεζ” ή “φαιά” λιποκύτταρα in vitro, μίας διαδικασίας που επίσης συμβαίνει in vivo και έχει σημαντικές συνέπειες στην ομοιόσταση, η φαρμακολογική τροποποίηση των επιπέδων του υδροθείου στα οποία εκτίθενται τα κύτταρα, επηρεάζει σημαντικά χαρακτηριστικά λειτουργικά μόρια που αποτελούν δείκτες της διαφοροποίησης και συμμετέχουν σε παθολογικές καταστάσεις όπως το μεταβολικό σύνδρομο και η αντίσταση στην ινσουλίνη. Βασιζόμενοι στα αποτελέσματα της μελέτης αυτής, προτείνουμε ότι το υδρόθειο, μέσω της μείωσης που επάγει τόσο στα επίπεδα έκφρασης της ρεζιστίνης και του αγγειοτενσινογόνου, παράγοντες που συνδέονται με νόσους του μεταβολικού συνδρόμου, αλλά και μέσω της ελάττωσης των επιπέδων των κυκλοφορούντων ελεύθερων λιπαρών οξέων, λόγω της μείωσης της διαδικασίας της λιπόλυσης, και μέσω της αύξηση της πρόσληψης της γλυκόζης που φαίνεται ότι προκαλεί, πιθανά δρα ευεργετικά και προστατευτικά σε κλινικές παραμέτρους του μεταβολικού συνδρόμου, βελτιώνοντας τη μεταβολική ομοιόσταση του οργανισμού.