Ευαίσθητα στο ΡΗ πολυμεροσώματα φέροντα σωματίδια χρυσού ως φορείς ελεγχόμενης χορήγησης πακλιταξέλης

• Κύριος συγγραφέας: Λιασκώνη, Αθηνά
• Άλλοι συγγραφείς: Αυγουστάκης, Κωνσταντίνος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2017
• Θέματα: Νανοσωματίδια χρυσού; Ευαίσθητα στο pH πολυμεροσώματα; Πολυμεροσώματα; Φυλλικό οξύ; Καρκίνος; Πακλιταξέλη; Νανοτεχνολογία; Συστήματα ελεγχόμενης χορήγησης φαρμάκων; Gold nanoparticles; pH - sensitive polymersomes; Polymersomes; Folic acd; Cancer; Paclitaxel; Nanotechnology; Controlled drug delivery systems (CDDS); 615.265 6

Η πακλιταξέλη αποτελεί ένα από τα πιο ευρέως διαδεδομένα χημειοθεραπευτικά φάρμακα κι έχει εγκριθεί ως αντικαρκινικό φάρμακο για τους καρκίνους των ωοθηκών, του μαστού, του τραχήλου της μήτρας, του ενδομητρίου, των πνευμόνων, της ουροδόχου κύστεως, της κεφαλής και για το κακόηθες μελάνωμα. Επιπλέον, ενδείκνυται για τη θεραπεία του σαρκώματος Kaposi σε ασθενείς με AIDS. Ωστόσο, η χρήση της με το συμβατικό σύστημα χορήγησης συνδέεται με την εμφάνιση σοβαρών και δυσάρεστων ανεπιθύμητων ενεργειών και αυτός ήταν ο λόγος που επέβαλε την εισαγωγή της σε Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης (CDDS). Αυτά τα συστήματα ελέγχουν το φαρμακοκινητικό προφίλ της δραστικής ουσίας και μειώνουν την τοξικότητά της μέσω της εκλεκτικής μεταφοράς της στον καρκινικό ιστό με μηχανισμούς παθητικής ή ενεργητικής στόχευσης ή ενεργοποιούμενης χορήγησης από ερεθίσματα. Ιδιαίτερα ελπιδοφόρα φαίνεται να είναι η ενσωμάτωση φαρμάκων σε νανοσωματίδια χρυσού. Η ακτινωτή φύση των υποκαταστατών τους δημιουργεί υδρόφοβες θέσεις μέσα στη μονοστοιβάδα τους κι έτσι, μπορεί να πραγματοποιηθεί η φόρτωση υδρόφοβων φαρμάκων σε αυτά. Ωστόσο, μέσω κατάλληλης τροποποίησης της επιφάνειάς τους είναι δυνατή η σύνδεση σε αυτά και υδρόφιλων φαρμάκων. Επίσης, με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η στοχευμένη χορήγηση των φορτωμένων σε αυτά ουσιών, η αύξηση της αποτελεσματικότητας και της σταθερότητάς τους, καλύτερη in vivo συμπεριφορά και υψηλότερη ενδοκυτταρική πρόσληψη. Χρησιμοποιούνται κυρίως για τη μελέτη χορήγησης αντινεοπλασματικών, αντιφλεγμονωδών, αντιικών και ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων. Ένα άλλο σύστημα ελεγχόμενης χορήγησης που είναι πολλά υποσχόμενο είναι τα πολυμεροσώματα. Η δομή πυρήνα – κελύφους των συγκεκριμένων νανοφορέων επιτρέπει τη χρησιμοποίησή τους σε μία μεγάλη ποικιλία ενεργών συστατικών, τόσο υδρόφιλων, όσο και υδρόφοβων. Μελετώνται κυρίως για τη χορήγηση αντινεοπλασματικών, αντιφλεγμονωδών, αντιικών και ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων. Η ενσωμάτωση δραστικών ουσιών σε πολυμεροσώματα έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της αποτελεσματικότητας και της σταθερότητάς τους, καλύτερη in vivo συμπεριφορά και υψηλότερη ενδοκυτταρική πρόσληψη. Χρησιμοποιούνται συνήθως πολυμεροσώματα των οποίων η συμπεριφορά εξαρτάται από τις συνθήκες του περιβάλλοντος στο οποίο βρίσκονται. Αυτό καθορίζεται από το είδος των πολυμερών από τα οποία παρασκευάζονται και τους προσδίδουν τις επιθυμητές ιδιότητες. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η στοχευμένη χορήγηση των φαρμάκων στους καρκινικούς ιστούς και η ελάττωση των παρενεργειών στις μη πάσχουσες περιοχές. Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματεύεται τη φόρτωση πακλιταξέλης σε τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού, τα οποία στη συνέχεια ενσωματώνονται σε ευαίσθητα στο pH πολυμεροσώματα, τα οποία έχουν παρασκευαστεί από το συμπολυμερές πολυ (2 – βινυλοπυριδίνη) – πολύ (αιθυλενοξείδιο) (P2VP – PEO) με σκοπό την απελευθέρωση των σωματιδίων χρυσού και συνεπώς και του φαρμάκου, εκλεκτικά στον καρκινικό όγκο όπου το pH είναι χαμηλότερο του φυσιολογικού. Το P2VP αποτελεί ένα βιοαποικοδομήσιμο πολυμερές, που είναι ευαίσθητο σε όξινο pH και αποικοδομείται όταν βρεθεί σε τέτοιο περιβάλλον, ενώ είναι σταθερό σε ουδέτερο pH κι έχει την ικανότητα ενσωμάτωσης υδρόφοβων ουσιών. Το PEO είναι ένα υδρόφιλο πολυμερές με υψηλή βιοσυμβατότητα και υδροφιλικότητα και το οποίο σχηματίζει το υδρόφιλο περίβλημα PEO, που εξασφαλίζει μεγάλη σταθερότητα σε υδατικά μέσα και αυξάνει το χρόνο κυκλοφορίας των συστημάτων στο πλάσμα του αίματος, μειώνοντας την πρόσληψη των πολυμεροσωμάτων από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα RES, προστατεύοντας με αυτόν τον τρόπο τις ενσωματωμένες φαρμακευτικές ουσίες. Παρασκευάστηκαν αρχικά νανοσωματίδια χρυσού με τη μέθοδο Brust – Schiffrin, των οποίων η επιφάνεια στη συνέχεια τροποποιήθηκε με φυλλικό οξύ. Ακολούθησε η παρασκευή ευαίσθητων στο pH πολυμεροσωμάτων με τη μέθοδο της ενυδάτωσης του υμενίου και η ενσωμάτωση σε αυτά των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού. Η σύνδεση των υποκαταστατών στα νανοσωματίδια χρυσού επιβεβαιώθηκε ποιοτικά και προσδιορίστηκε ποσοτικά με φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό. Η ενσωμάτωση των νανοσωματιδίων χρυσού στα πολυμεροσώματα προσδιορίστηκε επίσης φασματοφωτομετρικά. Επιπλέον, εξετάστηκε η σταθερότητα των διασπορών τόσο παρουσία ηλεκτρολυτών (NaCl) όσο και σε διαφορετικά pH με μέτρηση της υδροδυναμικής διαμέτρου και του επιφανειακού φορτίου, χρησιμοποιώντας την τεχνική της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Στη συνέχεια, εκτιμήθηκαν μορφολογικά τα νανοσωματίδια χρυσού και τα πολυμεροσώματα με τη βοήθεια ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης (ΤΕΜ). Το ποσοστό φόρτωσης της πακλιταξέλης στα νανοσωματίδια χρυσού, καθώς και στα πολυμεροσώματα που περιείχαν νανοσωματίδια χρυσού μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες αποδέσμευσης των νανοσωματιδίων χρυσού και του φαρμάκου από τα πολυμεροσώματα σε ρυθμιστικά υδατικά διαλύματα με διαφορετικές τιμές pH (pH 7,4 και 5,5) στους 37 οC για 48 h. Μελετήθηκε επίσης η φυσική κατάσταση της δραστικής ουσίας με τη βοήθεια της τεχνικής της περίθλασης ακτίνων Χ (XRD). Ακολούθησαν κυτταρικές μελέτες κατά τις οποίες μελετήθηκε αρχικά η κυτταροτοξικότητα των φορτωμένων με πακλιταξέλη νανοσωματιδίων χρυσού, που είχαν ενσωματωθεί σε πολυμεροσώματα και συγκρίθηκε με εκείνη των κενών νανοφορέων, αλλά και του ελεύθερου φαρμάκου. Αυτός ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε με χρώση των καρκινικών κυττάρων (καρκινική σειρά Α549) με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και μέτρηση του φθορισμού των νεκρών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η ικανότητα πρόκλησης απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα από τα φορτωμένα με πακλιταξέλη νανοσωματιδία χρυσού, που είχαν ενσωματωθεί σε πολυμεροσώματα και συγκρίθηκε με εκείνη των κενών νανοφορέων, αλλά και του ελεύθερου φαρμάκου. Αυτό έγινε με την τεχνική της διπλής χρώσης με αννεξίνη (FITC Annexin V) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) των καρκινικών κυττάρων και κυτταρομετρία ροής. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν ποιοτικές και ποσοτικές μελέτες ενδοκυττάρωσης των νανοφορέων. Οι μελέτες αυτές πραγματοποιήθηκαν μέσω χρώσης των πολυμεροσωμάτων με ροδαμίνη και των πυρήνων των κυττάρων με DAPI. Η ενδοκυττάρωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής, μικροσκοπία φθορισμού και συνεστιακή μικροσκοπία. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν έδειξαν ότι τα ευαίσθητα στο pH πολυμεροσώματα, που περιείχαν τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού, εμφανίζουν κατάλληλες φυσικοχημικές ιδιότητες και υψηλή κολλοειδή σταθερότητα παρουσία ηλεκτρολυτών. Η φόρτωση του αντικαρκινικού φαρμάκου στα τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού ήταν 5,91 % w/w. Η ενκαψακίωση των φορτωμένων με φάρμακο νανοσωματιδίων χρυσού στα ευαίσθητα στο pH πολυμεροσώματα ήταν 73,95 % w/w, ενώ η φόρτωση του φαρμάκου στα πολυμεροσώματα ήταν 5,00 % w/w. Το φορτωμένο φάρμακο φαίνεται να βρίσκεται μέσα στους νανοφορείς σε άμορφη (μη-κρυσταλλική) κατάσταση. Αποδείχτηκε ότι πράγματι τα πολυμεροσώματα ήταν ευαίσθητα στο pH καθώς το ζ-δυναμικό τους έγινε θετικό σε όξινο pH (pH = 5,5), ενώ σε ουδέτερο pH (pH = 7,4) παρέμενε αρνητικό. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς παρουσιάζουν παρατεταμένη αποδέσμευση της πακλιταξέλης, αλλά και των νανοσωματιδίων χρυσού σε όξινο pH (pH = 5,5), ενώ αντίθετα σε ουδέτερο pH (pH = 7,4) η αποδέσμευσή τους είναι πολύ μικρή. Τα κενά χωρίς φάρμακο φορτωμένα με νανοσωματίδια χρυσού πολυμεροσώματα δεν παρουσίασαν κυτταροτοξικότητα. Οι φορτωμένοι με φάρμακο νανοφορείς προκάλεσαν μεγαλύτερη in vitro αντικαρκινική δραστικότητα από το ελεύθερο φάρμακο σε αντίστοιχες δόσεις. Τα κενά χωρίς φάρμακο φορτωμένα με νανοσωματίδια χρυσού πολυμεροσώματα προκαλούν χαμηλό ποσοστό απόπτωσης στα κύτταρα, το οποίο ήταν 4,39 %. Το ελεύθερο φάρμακο προκαλεί μόνο πρώιμη απόπτωση στα κύτταρα και δεν τα οδηγεί σε τελικό στάδιο απόπτωσης, ενώ τα φορτωμένα με φάρμακο πολυμεροσώματα προκαλούν τελικό στάδιο απόπτωσης σε ποσοστό 11,96 %, κάτι που οδηγεί τα κύτταρα σε κυτταρικό θάνατο. Με βάση τα αποτελέσματα της συνεστιακής μικροσκοπίας τα φορτωμένα με νανοσωματίδια χρυσού πολυμεροσώματα παρουσιάζουν πολύ υψηλό ποσοστό ενδοκυττάρωσης, το οποίο ήταν 94,80 %. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα συμπεραίνεται ότι το συγκεκριμένο νανοσύστημα χορήγησης πακλιταξέλης εμφανίζει σταθερότητα, pH-αποκρινόμενη αποδέσμευση και in vitro αντικαρκινική δραστικότητα και συνεπώς, αξίζει περαιτέρω έρευνας για τη δυνατότητα αξιοποίησής του ως σύστημα εκλεκτικής χορήγησης της πακλιταξέλης σε καρκινικούς όγκους.