Γονιδιοτοξική μελέτη νέων φαρμακευτικών ενώσεων με αντικαρκινική δράση σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro

• Κύριος συγγραφέας: Αργυροπούλου, Μαργαρίτα Αθανασία
• Άλλοι συγγραφείς: Στεφάνου, Γεωργία
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2017
• Θέματα: Μελφαλάνη; Κυτταροτοξικότητα; Χρωμοσωματική αστάθεια; Μικροπυρήνες; Θραύση του DNA; Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων; Μέθοδος CBMN; Μέθοδος SCGE (Comet assay); Melphalan; Cytotoxicity; Chromosomal instability; Micronuclei; DNA breakage; Base Excision Repair (BER); CBMN assay; SCGE assay (Comet assay); 616.994 061 072 4

Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η ικανότητα τεσσάρων νέων στεροειδών παραγώγων της μελφαλάνης να προκαλούν χρωμοσωματική αστάθεια σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος. Η μελφαλάνη ανήκει στην κατηγορία των αλκυλιωτικών παραγόντων με κυτταροστατική ικανότητα. Παρουσιάζει θεραπευτική δράση σε διάφορες μορφές κακοήθειας, όπως πολλαπλό μυέλωμα, λεμφώματα των ωοθηκών και καρκίνο του μαστού. Οι ενώσεις SN-A, SN-B, SN-C και SN-D συντέθηκαν μέσω προσθήκης ενός στεροειδικού σκελετού στο μόριο της μελφαλάνης, με κύριο σκοπό τη βελτίωση της δραστικότητάς της. Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης (Cytokinesis-Block Micronucleus Assay, CBMN). Αναπτύχθηκαν καλλιέργειες λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος in vitro, από δύο υγιείς, νεαρής ηλικίας και μη καπνιστές δότες, αρσενικού και θηλυκού φύλου, στις οποίες επιδράσαμε με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις των τεσσάρων παραγώγων. Κατά τη μέθοδο αυτή αναστέλλεται η κυτταροκίνηση που λαμβάνει χώρα μετά την πρώτη πυρηνική διαίρεση των λεμφοκυττάρων, με τη χρήση κατάλληλου αναστολέα, χωρίς να παρεμποδίζεται η πυρηνική διαίρεση. Αποτέλεσμα αυτής της αναστολής είναι κύτταρα που έχουν διαιρεθεί μια φορά να εμφανίζονται ως μεγάλα διπύρηνα κύτταρα. Στα κύτταρα αυτά ανιχνεύεται η χρωμοσωματική βλάβη που ενδεχομένως έχουν υποστεί. Ως γενετικός δείκτης της χρωμοσωματικής βλάβης, χρησιμοποιήθηκαν οι μικροπυρήνες (MN). Πρόκειται για εξωπυρηνικό υλικό, προερχόμενο από χρωμοσωματική θραύση ή απώλεια χρωμοσωμάτων. Με την ίδια μέθοδο διερευνήθηκε ο ρυθμός προόδου του κυτταρικού κύκλου και η κυτταροτοξικότητα. Επίσης, μελετήθηκε η πρόκληση της απόπτωσης και της νέκρωσης των κυττάρων, καθώς είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανίχνευση αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων. Επιπλέον, εξετάστηκε η θραύση του DNA υπό την επίδραση των παραγώγων της μελφαλάνης, με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (Single Cell Gel Electrophoresis assay, SCGE/ comet assay) κάτω από αλκαλικές συνθήκες. Σε αυτές τις συνθήκες οι υπερέλικες του DNA χαλαρώνουν και ξεδιπλώνονται, με αποτέλεσμα να είναι δυνατή η ανίχνευση ρηγμάτων στο DNA καθώς και θέσεων ασταθών σε αλκαλικές συνθήκες (alkali labile sites) κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης, οι οποίες εμφανίζονται σαν ουρές ενός κομήτη. Για την ποσοτικοποίηση των ρηγμάτων στο DNA εκτιμήθηκαν οι παράμετροι % DNA in head, % DNA in tail, tail intensity, tail length, tail moment και olive tail moment. Επίσης, έγινε έλεγχος για το αν οι βλάβες που προκαλούνται στο DNA λόγω αλκυλίωσης επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής βάσεων. Η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης σε συνδυασμό με την κυτοσίνη της αραβινοσίδης (ARA-C) επιτρέπει την ανίχνευση βλαβών στο DNA που επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής. Η ARA-C δρα αναστέλλοντας τον πολυμερισμό του DNA, κατά την επιδιόρθωση των τροποποιημένων βάσεων, δημιουργώντας έτσι ρήγματα στο DNA, τα οποία μετατρέπονται σε μικροπυρήνες μετά από την αντιγραφή του DNA. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, τα τέσσερα χημικά παράγωγα της μελφαλάνης παρουσιάζουν αυξημένη κυτταροτοξική δράση, όπως υποδεικνύει η μείωση του δείκτη CBPI και η αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. Επιπλέον, προκαλούν αυξημένη χρωμοσωματική αστάθεια, όπως φαίνεται από την αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων, η οποία σχετίζεται θετικά με την αύξηση της συγκέντρωσης των χημικών ενώσεων. Ωστόσο, δεν υπάρχουν σαφή ευρήματα για την επαγωγή της απόπτωσης. Η χημική ένωση SN-D επάγει τη δημιουργία ρηγμάτων στο DNA, όπως προκύπτει από τη μετακίνηση του DNA στην ουρά του κομήτη κατά την ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικές συνθήκες, υποδεικνύοντας ότι η θραύση του DNA αποτελεί τουλάχιστον έναν από τους μηχανισμούς που προκαλούν την εμφάνιση μικροπυρήνων στα μεσοφασικά κύτταρα. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι η χημική ένωση SN-D δημιουργεί βλάβες στο DNA, οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής βάσεων, BER (Base Excision Repair).