Επιγενετικοί μηχανισμοί φυλετικής πλαστικότητας στον εγκέφαλο του Zebrafish (Danio Rerio)

• Κύριος συγγραφέας: Μακαντάση, Παναγιώτα
• Άλλοι συγγραφείς: Δερμών, Αικατερίνη
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2017
• Θέματα: Φυλετική πλαστικότητα; 17-β οιστραδιόλη; Νευρογένεση; Κοινωνική ιεραρχία; Αδρενεργικό σύστημα; Sexual plasticity; 17-β estradiol; Neurogenesis; Social hierarchy; Adrenergic system; Zebrafish; 573.838

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η κατανόηση φύλο-εξαρτώμενων επιγενετικών μηχανισμών πλαστικότητας του εγκεφάλου με βάση το νευρογενετικό μοντέλο - οργανισμό zebrafish (Danio rerio). Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν, ο ρόλος της ορμόνης Ε2 (φυλετική πλαστικότητα) και της κοινωνικής ιεραρχίας (κοινωνικά πλαστικότητα) στον ενήλικο εγκέφαλο. Επίσης, διερευνήθηκε ο ρόλος της οιστραδιόλης στα εγκεφαλικά κυκλώματα που ελέγχουν την κοινωνική συμπεριφορά. Η γέννηση νέων κυττάρων στον ενήλικο εγκέφαλο, αποτελεί κύριο μηχανισμό πλαστικότητας και οι τελεόστεοι ιχθύες ιδιαίτερα, παρουσιάζουν εκπληκτική ικανότητα νευρογένεσης σε ολόκληρο τον προσθιο-οπίσθιο άξονα του εγκεφάλου τους, σε διακριτές ζώνες πολλαπλασιασμού, καθόλη τη διάρκεια της ζωής τους. Η διαδικασία της νευρογένεσης επηρεάζεται από ποικίλους παράγοντες όπως το φύλο, την ηλικία, από τις περιβαλλοντικές ή εποχικές συνθήκες, στρεσογόνα ερεθίσματα, νευροδιαβιβαστές, αυξητικούς παράγοντες ακόμη, ορμόνες. Οι φυλετικές ορμόνες επιδρούν με σύνθετους τρόπους στο ρυθμό παραγωγής νέων κυττάρων στον ενήλικο εγκέφαλο. Διακυμάνσεις στα επίπεδα των ανδρογόνων στα θηλαστικά επηρεάζουν τη γέννηση και την επιβίωση των νευρώνων στην οδοντωτή έλικα αρσενικών τρωκτικών. Τα οιστρογόνα παρουσιάζουν οργανωτικές και νευροπροστατευτικές λειτουργίες στον εγκέφαλο των θηλαστικών και των πτηνών. Η 17-β οιστραδιόλη μέσω πρόσδεσης της στους οιστρογονικούς υποδοχείς α και β, ρυθμίζει τον σχηματισμό των συνάψεων, τη διαφοροποίηση των κυττάρων, ενώ οι δράσεις της στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό είναι περίπλοκες, και εξαρτώνται από το είδος, το φύλο, την εγκεφαλική περιοχή. Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων επιτελεί το έργο της η 17-β οιστραδιόλη είναι είτε γενωμικοί, μέσω πυρηνικών υποδοχέων, μακράς διάρκειας, ενδοκυτταρικές επιγενετικές τροποποιήσεις στην έκφραση γονιδίων, ευαίσθητοι στη δράση αναστολέων της αντιγραφής και της μετάφρασης, είτε μη γενωμικοί, ταχείς διεργασίες ενδοκυττάριας τροποποίησης μονοπατιών μεταγωγής σήματος. Η γέννηση νέων κυττάρων στον εγκέφαλο των τελεόστεων ξεκινά από πληθυσμούς βλαστικών κυττάρων με δυνατότητα αυτοανανέωσης, με χαρακτηριστά ακτινωτής γλοίας, τα οποία εκφράζουν αρωματάση Β, το ένζυμο κλειδί για τη de novo σύνθεση της 17-β οιστραδιόλης στον εγκέφαλο. Η ενεργότητα της AroB στον εγκέφαλο των τελεόστεων είναι 100 με 1000 φορές μεγαλύτερη από εκείνη των θηλαστικών ή των πτηνών και εντοπίζεται στους οσφρητικούς λοβούς, τον τελεγκέφαλο, την προοπτική περιοχή, τον υποθάλαμο, την υπόφυση και την παρεγκεφαλίδα. Παρόλη την εκτεταμένη επιστημονική έρευνα στις επιδράσεις της οιστραδιόλης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στον εγκέφαλο των θηλαστικών, οι γνώσεις μας για τις επιδράσεις των οιστρογόνων στη γέννηση νέων κυττάρων στους ενήλικους ιχθύες είναι αρκετά περιορισμένες. Η διερεύνηση της επίδρασης των οιστρογόνων και συγκεκριμένα της 17-β οιστραδιόλης στη ρύθμιση της γέννησης νέων κυττάρων στον εγκέφαλο του τελεόστεου Danio rerio αποτέλεσε κύριο στόχο της παρούσας διατριβής. Για το σκοπό αυτό, χορηγήθηκε 17-β οιστραδιόλη σε ενήλικα zebrafish για τη χρονική περίοδο 24 ωρών και 7 ημερών και με ανοσοϊστοχημικό εντοπισμό χαρτογραφήθηκαν ποσοτικά με στερεολογία τα νεογεννηθέντα κύτταρα σε διακριτές ζώνες πολλαπλασιασμού, σε όλο το μήκος του προσθιο-οπίσθιου άξονα του εγκεφάλου. Η 17-β οιστραδιόλη τροποποίησε σημαντικά με φυλο εξαρτώμενο τρόπο το ρυθμό πολλαπλασιασμού στις υπό μελέτη περιοχές, και οι δράσεις της βρέθηκαν ανάλογες του χρόνου χορήγησης της. Κατά τη βραχεία χορήγηση, προκάλεσε αύξηση του αριθμού των νεογεννηθέντων κυττάρων στην προοπτική περιοχή και το ραχιαίο πυρήνα του κοιλιακού τελεγκεφάλου των ενήλικων zebrafish και για τα δύο φύλα, ενώ επηρέασε θετικά τον κοιλιακό υποθάλαμο μόνο των θηλυκών ατόμων και τον κοιλιακό πυρήνα του κοιλιακού τελεγκεφάλου και την πλάγια ζώνη του ραχιαίου τελεγκεφάλου μόνο των αρσενικών ατόμων. Αντιθέτως, μετά από μακρά χορήγηση 17-β οιστραδιόλης, αξιοσημείωτη μείωση νευρογένεσης παρατηρήθηκε σε τρεις πυρήνες της παρεγκεφαλίδας (Val, Vam, CCe) και στην προοπτική περιοχή και στα δύο φύλα, ενώ με φυλοεξαρτώμενο τρόπο επέδρασε στον κοιλιακό υποθάλαμο, και τον τελεγκέφαλο. Διάφορες έρευνες προτείνουν τη αλληλεπίδραση των οιστρογόνων με τις μονοαμίνες στα θηλαστικά. Καθώς αντίστοιχη μελέτη δεν έχει πραγματοποιηθεί στο zebrafish, προχωρήσαμε στη διερεύνηση της σχέσης των μονοαμινών και των οιστρογόνων ακολουθώντας το πρωθύστερο σχήμα χορήγησης 17-β οιστραδιόλης σε αρσενικά και θηλυκά zebrafish για 7 μέρες. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων της νοραδρεναλίνης, ντοπαμίνης και σεροτονίνης επιλέχθηκε η μέθοδος της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC) με ηλεκτροχημικό ανιχνευτή, ενώ μελετήθηκε και η κατανομή των αδρενεργικών υποδοχέων α2Α και β2 με ανοσοφθορισμό. Έτσι, η 17-β οιστραδιόλη βρέθηκε να τροποποιεί τη λειτουργία της ντοπαμίνης και σεροτονίνης στον ενήλικο εγκέφαλο του zebrafish, καθώς και της έκφρασης των α2Α αδρενεργικών υποδοχέων, σε πυρήνες του τελεγκεφάλου και της παρεγκεφαλίδας, και των β2 αδρενεργικών υποδοχέων στον ραχιαίο πυρήνα του υποθαλάμου (Hd) των θηλυκών, καταδεικνύοντας την τροποποιητική δράση των οιστρογόνων στη δομή και τη λειτουργία των νευρωνικών κυκλωμάτων. Η κοινωνική συμπεριφορά αποτελεί άλλον ένα σημαντικό μηχανισμό πλαστικότητας του ενήλικου εγκεφάλου. Η μελέτη της αμφίδρομης σχέσης μεταξύ εκδήλωσης της συμπεριφοράς και λειτουργίας των νευρικών κυκλωμάτων που την ελέγχουν αποτέλεσε στόχο της διατριβής. Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε ποσοτική στερεολογική χαρτογράφηση των βλαστικών νευρικών και της διαφοροποίησης τους, καθώς και των νευροδιαβιβαστικών συστημάτων που χαρακτηρίζουν τα εγκεφαλικά νευρικά κυκλώματα που συμμετέχουν στην εκδήλωση της φύλο-εξαρτώμενης ιεραρχικής συμπεριφοράς. Η επιθετική συμπεριφορά για την απόκτηση κυριαρχίας που παρατηρείται σε πληθυσμούς ιχθύων ποσοτικοποιήθηκε με χρήση παραμέτρων κυριαρχικής συμπεριφοράς (επιθέσεις, τσιμπήματα, δαγκώματα, κυνηγητά) σε δυάδες ιχθύων με πολυήμερη βιντεοσκόπηση. Η ανάλυση των βιντεοσκοπήσεων χρησιμοποιήθηκε επίσης για την ποσοτικοποίηση του δείκτη κυριαρχίας που κατέδειξε την καθιέρωση σταθερών κοινωνικών σχέσεων στα προς μελέτη ζευγάρια zebrafish. Η ποσοτικοποίηση των νεογεννηθέντων κυττάρων έδειξε μείωση του ρυθμού του πολλαπλασιασμού στην παρεγκεφαλίδα, στον υποθάλαμο και στους πυρήνες του ραχιαίου τελεγκεφάλου που ανήκουν στο μεταιχμιακό σύστημα, στα υποτελή αρσενικά άτομα. Επίσης, προσδιορίστηκαν χαμηλότερα επίπεδα α2Α αδρενεργικών υποδοχέων στον ραχιαίο τελεγκέφαλο των υποτελών ιχθύων ενώ αντίστοιχη μείωση παρουσίασαν τα επίπεδα των β2 υποδοχέων τόσο στον ραχιαίο τελεγκέφαλο όσο και στον υποθάλαμο. Τα αποτελέσματα από την παρούσα διατριβή παρουσιάζουν την επίδραση της κοινωνικής ιεραρχικής συμπεριφοράς στη γέννηση νέων κυττάρων και τη λειτουργία του αδρενεργικού συστήματος και προτείνουν την ύπαρξη ενός Δικτύου Εγκεφαλικού Ελέγχου της Κοινωνικής Συμπεριφοράς (SBN) αντίστοιχο των θηλαστικών που περιλαμβάνει την αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο, την προοπτική περιοχή, τον κοιλιακό υποθάλαμο και την παρεγκεφαλίδα. Για την πληρέστερη κατανόηση των μηχανισμών φυλετικής πλαστικότητας στον εγκέφαλο, διερευνήθηκε η σχέση μεταξύ της κοινωνικής ιεραρχίας και της επιγενετικής δράσης της οιστραδιόλης, στην τροποποίηση των εγκεφαλικών κυκλωμάτων που προσδιορίστηκαν ότι συμβάλλουν στην φυλο-εξαρτώμενη συμπεριφορά. Μετά από επταήμερη χορήγηση 17-β οιστραδιόλης σε καθιερωμένο πρότυπο κυριαρχίας, σε δυάδες αρσενικών zebrafish με σταθερές κοινωνικές δομές ποσοτικοποιήθηκαν οι δείκτες κυριαρχίας, ο ρυθμός κυτταρικού πολλαπλασιασμού στις νευρογενείς ζώνες του εγκεφάλου και η κατανομή και έκφραση των α2Α και β2 αδρενεργικών υποδοχέων, σε αντιστοιχία με τα πρωθύστερα τμήματα της διατριβής. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ του δείκτη κυριαρχίας των ατόμων που έλαβαν οιστρογόνα για 7 μέρες και των ατόμων ελέγχου, καθώς και τροποποίηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού στις περιοχές επίδρασης της ιεραρχικής συμπεριφοράς στον τελεγκέφαλο και την παρεγκεφαλίδα των κυρίαρχων και υποτελών ατόμων. Τα αποτελέσματα από την παρούσα διατριβή υποδεικνύουν την ύπαρξη επιγενετικών μηχανισμών πλαστικότητας στον εγκέφαλο του Danio rerio που σχετίζονται με τη λειτουργία του αδρενεργικού συστήματος και τη δομική πλαστικότητα με την παραγωγή νέων κυττάρων. Τα οιστρογόνα αλλά και η ιεραρχική κοινωνική συμπεριφορά φαίνεται πως αποτελούν σημαντικούς ρυθμιστές των νευρωνικών κυκλωμάτων του εγκεφάλου των ιχθύων, επηρεάζοντας αξιοσημείωτα τη νευρογένεση και τη λειτουργία νευροδιαβιβαστικών κυκλωμάτων.