Μελέτη της σύστασης οσφυϊκών σπονδύλων και μηριαίων οστών πειραματόζωων με έλλειψη του γονιδίου ApoE με φασματοσκοπία Raman και τεχνικές στοιχειακής και θερμικής ανάλυσης
Το οστό είναι μια φυσική πολύπλοκη ένωση, που ακολουθεί ιεραρχική δόμηση. Αποτελείται από ένα οργανικό και ένα ανόργανο υπόστρωμα, καθώς και από νερό. Σε μοριακό επίπεδο περιλαμβάνει ένα δίκτυο πολυμερικών πρωτεϊνών, κυρίως κολλαγόνο τύπου Ι, και νανοσωματίδια βιοαπατίτη, που ενισχύουν την κολλαγονι...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2017
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/10653 |
| id |
nemertes-10889-10653 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Γονίδιο ApoE Ποιότητα οστού Οσφυϊκοί σπόνδυλοι Φασματοσκοπία Raman ApoE gene Bone quality Vertebrae Raman spectroscopy 573.76 |
| spellingShingle |
Γονίδιο ApoE Ποιότητα οστού Οσφυϊκοί σπόνδυλοι Φασματοσκοπία Raman ApoE gene Bone quality Vertebrae Raman spectroscopy 573.76 Γκίβαλος, Γεώργιος Μελέτη της σύστασης οσφυϊκών σπονδύλων και μηριαίων οστών πειραματόζωων με έλλειψη του γονιδίου ApoE με φασματοσκοπία Raman και τεχνικές στοιχειακής και θερμικής ανάλυσης |
| description |
Το οστό είναι μια φυσική πολύπλοκη ένωση, που ακολουθεί ιεραρχική δόμηση. Αποτελείται από ένα οργανικό και ένα ανόργανο υπόστρωμα, καθώς και από νερό. Σε μοριακό επίπεδο περιλαμβάνει ένα δίκτυο πολυμερικών πρωτεϊνών, κυρίως κολλαγόνο τύπου Ι, και νανοσωματίδια βιοαπατίτη, που ενισχύουν την κολλαγονική δομή, προσφέροντας στην τελευταία αντοχή στη θραύση.
Ειδικότερα, μπορεί να αυξήσει ή να μειώσει την αντοχή στη θραύση λόγω εγγενών (λ.χ. γήρανση, μεταβολικές ασθένειες) όσο και εξωγενών μηχανισμών (λ.χ. κατευθυντήριες δυνάμεις).
Ιδιότητες του οστού όπως, η σκληρότητα, η πλαστικότητα αναπτύσσονται στην κλιμακούμενη ιεραρχική δόμηση του οστίτη ιστού, η οποία εκτείνεται από την νανοκλίμακα έως την μακροκλίμακα. Τα σκελετικά κατάγματα αποτελούν μια σημαντική ιατρική και οικονομική επιβάρυνση. Μόνο στις ΗΠΑ, τα κατάγματα στο ισχίο, στη σπονδυλική στήλη και στον καρπό αντιπροσώπευαν πάνω από 17 δισεκατομμύρια δολάρια σε άμεσες δαπάνες υγειονομικής περίθαλψης το 2001 και το ετήσιο αυτό κόστος συνεχώς αυξάνεται. Επιπλέον, τα κατάγματα δεν περιορίζονται μόνο στους ηλικιωμένους, αλλά αποτελούν επίσης και ένα σημαντικό πρόβλημα νεότερων ατόμων.
H παρούσα μελέτη στοχεύει στη διερεύνηση του ρόλου του γονιδίου ApoE στην ποιότητα των οστών. Για το σκοπό αυτό, μηριαία οστά και σπόνδυλοι μυών με εκτοπισμένο γονίδιο αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν με μάρτυρες. Η κύρια λειτουργία του γονιδίου αυτού είναι ο έλεγχος του μεταβολισμού των λιπιδίων. Επίσης, έχει ευρύτερο ρόλο στην ανοσολογία και στην ανοσορύθμιση.
Η χημική σύσταση του οστίτη ιστού είναι ένας σημαντικός παράγοντας, που συνεισφέρει στην ποιότητα του οστού και έχει σημαντική συμβολή στις μηχανικές του ιδιότητες, καθώς και στη χωρική και χρονική συσσώρευση των μικροκαταγμάτων. Η παρατήρηση αυτής ιδιαίτερα σε δομικό επίπεδο διευκολύνεται από την ανάπτυξη βελτιωμένων μέσων ορισμού και μέτρησης της ποιότητας του οστίτη ιστού.
Ειδικότερα, φασματοσκοπικές τεχνικές απεικόνισης επιτρέπουν την άμεση παρατήρηση δημιουργίας οστικής ρωγμής και ανάπτυξης αυτής και είναι πολύτιμες για την αποκρυπτογράφηση μηχανισμών επαγωγής θραύσης.
Η σύσταση και η ποιότητα του οστίτη ιστού αξιολογήθηκε με τη χρήση της φασματοσκοπίας Raman, μιας μη επεμβατικής τεχνικής, η οποία είναι κατάλληλη για τη μελέτη βιουλικών, διότι επιτρέπει την ταυτόχρονη μελέτη του οργανικού και του ανόργανου συστατικού τους, χωρίς το δείγμα να υποστεί κάποια ιδιαίτερη επεξεργασία. Επίσης η φασματοσκοπία Raman πλεονεκτεί άλλων τεχνικών, καθότι παρέχει τη δυνατότητα ανάλυσης φρέσκων ενυδατωμένων οστών με υψηλή χωρική ανάλυση (όγκοι δείγματος του 1μm3 ή λιγότερο).
Η φασματοσκοπία Raman είναι μια δονητική φασματοσκοπική τεχνική, η οποία χρησιμοποιείται για την εκτίμηση του σκεδαζόμενου φωτός βιολογικών μορίων και ιόντων.
Η σκέδαση Raman συμβαίνει όταν μόρια εντός του δείγματος διεγείρονται από την προσπίπτουσα ακτινοβολία laser. Λόγω των δονητικών κινήσεων των μορίων, ένα μικρό κλάσμα του φωτός (περίπου 1 στα 107 φωτόνια) χάνει ενέργεια και προκαλεί σκέδαση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας σε μεγαλύτερα μήκη κύματος. Η διαφορά στο μήκος κύματος μεταξύ σκεδαζόμενης και προσπίπτουσας δέσμης φωτός αντιστοιχεί σε μοριακές δονήσεις και οδηγεί σε ζώνες χαρακτηριστικών μετατοπίσεων συχνότητας στο φάσμα Raman.
Οι μετατοπίσεις αυτές μετρούνται σε κυματαριθμικές μονάδες (cm-1) και είναι ανάλογες με την ενέργεια δόνησης. Οι μετατοπίσεις συχνότητας χρησιμεύουν στην εκτίμηση της σύνθεσης του οστίτη ιστού.
Παράδειγμα αποτελεί η εκτίμηση της ανθρακικής υποκατάστασης στο κρυσταλλικό πλέγμα του βιοαπατίτη (πραγματοποιείται κυρίως υποκατάσταση β-τύπου; Μερική υποκατάσταση των ορθο-φωσφορικών από ανθρακικά ανιόντα).
Η εξωκυττάρια μήτρα παρέχει επίσης πληροφόρηση για τη σύνθεση του οστίτη ιστού, δεδομένου του ότι είναι πηγή πλούσια σε δονήσεις πρωτεϊνών, οι οποίες συνιστούν τη δευτεροταγή δομή, όπως εκείνης του αμιδίου και των πλευρικών αμινοξικών αλυσίδων.
Η φασματοσκοπία Raman αποδίδει τέσσερις (4) τουλάχιστον σημαντικούς δείκτες της «ποιότητας του οστού», ένας όρος, ο οποίος αναφέρεται στο σύνολο συνθετικών και αρχιτεκτονικών ιδιοτήτων του οστίτη ιστού.
Οι δείκτες αυτοί είναι: η αναλογία ανόργανου προς οργανικού συστατικού, η αναλογία ανθρακικών - φωσφορικών ιόντων, η κρυσταλλικότητα και η παράμετρος εκτίμησης της ποιότητας του κολλαγονικού δικτύου.
Πραγματοποιήθηκε λήψη πληθώρας φασμάτων Raman στην παρούσα μελέτη. Ειδικότερα, μετρήθηκαν εμβαδά και ύψη, που αντιστοιχούσαν στον αντίστροφο λόγο των εντάσεων της κύριας κορυφής των φωσφορικών, στην αναλογία των εντάσεων της κύριας κορυφής των ανθρακικών και της κύριας κορυφής των φωσφορικών και του λόγου των εντάσεων κορυφών, οι οποίες αποδίδονται στην πρωτεϊνική μήτρα.
Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κρυσταλλικότητα και ο δείκτης, που καταδεικνύει το ποσοτό της ασβεστοποίησης της κολλαγονικής μήτρας δεν παρουσιάζουν καμία στατιστικά σημαντική μεταβολή για τις ομάδες των μηριαίων οστών. Για τους οσφυϊκούς σπονδύλους, ο τελευταίος λόγος ήταν αυξημένος για την ομάδα εκείνη που στερούταν το γονίδιο ApoE, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η αναλογία των κορυφών της περιοχής του αμιδίου Ι και ο δείκτης, που εκφράζει το βαθμό της β-υποκατάστασης βρέθηκαν αυξημένοι για την πειραματική ομάδα μηριαίων οστών και οσφυϊκών σπονδύλων, σε σύγκριση με τους μάρτυρες, γεγονός που υποδηλώνει, πως η έλλειψη του γονιδίου ApoE οδηγεί σε μείωση της ελαστικότητας του κολλαγονικού δικτύου και της ακαμψίας και επομένως σε αυξημένη ευθραυστότητα του οστού.
H φασματοσκοπική ανάλυση των πειραματόζωων με την τεχνική Raman έδειξε πως, οι οσφυϊκοί σπόνδυλοι εμφανίζουν σοβαρότερη υποβάθμιση του κολλαγονικού τους δικτύου και μειωμένη οστική αντοχή σε σχέση με τα μηριαία οστά, η οποία δύναται να οφείλεται στην μειωμένη των τελευταίων σε σχέση με τους πρώτους οστική αναδόμηση.
Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε η επεμβατική αναλυτική τεχνική ΑΑS (φασματοσκοπία ατομικής απορρόφησης), για τη μέτρηση της περιεκτικότητας των οσφυϊκών σπονδύλων σε ασβέστιο. Η φασματομετρική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα ασβεστίου (διαδικασία του εμβολιασμού) και 2.5% La2O3 για την ελαχιστοποίηση φασματικών και χημικών παρεμποδίσεων της μήτρας διαλυμάτων βιοαπατίτη, που απομονώθηκαν από το κολλαγόνο χρησιμοποιώντας HNO3 0.5 N (όξινη πέψη).
Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε μελέτη της περιεκτικότητας των οσφυϊκών σπονδύλων σε κολλαγόνο, χρησιμοποιώντας την αναλυτική τεχνική TGA (θερμοσταθμική ανάλυση). Η τελευταία χρησιμοποιείται για την εκτίμηση του οργανικού περιεχομένου του οστού. Ιδιαίτερα, η καμπύλη της πρώτης παραγώγου του θερμογραφήματος επιτρέπει τον προσδιορισμό της απώλειας οστικής οργανικής μάζας.
To βασικό συμπέρασμα που εξήχθη, ήταν η μειωμένη περιεκτικότητα σε κολλαγόνο των -/- ApoE σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου των συγκεκριμένων δειγμάτων.
Φασματομετρία ατομικής απορρόφησης, σε συνδυασμό με την καταστροφική για τα δείγματα αναλυτική τεχνική TGA χρησιμοποιήθηκαν για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων Raman και ιδίως για τον έλεγχο του λόγου MMR (εκφράζει τη σχετική ποσοτική αναλογία ανόργανου - οργανικού τμήματος του οστίτη ιστού).
Τέλος, χρησιμοποιήθηκε η αναλυτική τεχνική ΤXRF (φθορισμός ακτίνων Χ με ολική ανάκλαση), για την εκτίμηση της περιεκτικότητας του οστού σε ασβέστιο και σε φωσφόρο, για την επίγνωση της δομικής σύνθεσης του βιοαπατίτη και για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της AAS.
Δύναται να πραγματοποιηθούν ποικίλες υποκαταστάσεις στο κρυσταλλικό πλέγμα του βιοπατίτη τόσο στην κατιοντική θέση του ασβεστίου όσο και στην ανιοντική πλευρά των φωσφορικών ιόντων. Οι υποκαταστάσεις αυτές είναι δυνατόν να επηρεάσουν τις φυσικοχημικές ιδιότητες του οστίτη ιστού, όπως τη διαλυτότητα, την πυκνότητα, τη σκληρότητα και την μορφολογία οστικής ανάπτυξης. Η σύνθεση των οστών έχει δειχθεί, ότι μεταβάλλεται με την ηλικία και πως επηρεάζεται από μεταβολικές διαταραχές και θεραπευτικές αγωγές. |
| author2 |
Όρκουλα, Μαλβίνα |
| author_facet |
Όρκουλα, Μαλβίνα Γκίβαλος, Γεώργιος |
| format |
Thesis |
| author |
Γκίβαλος, Γεώργιος |
| author_sort |
Γκίβαλος, Γεώργιος |
| title |
Μελέτη της σύστασης οσφυϊκών σπονδύλων και μηριαίων οστών πειραματόζωων με έλλειψη του γονιδίου ApoE με φασματοσκοπία Raman και τεχνικές στοιχειακής και θερμικής ανάλυσης |
| title_short |
Μελέτη της σύστασης οσφυϊκών σπονδύλων και μηριαίων οστών πειραματόζωων με έλλειψη του γονιδίου ApoE με φασματοσκοπία Raman και τεχνικές στοιχειακής και θερμικής ανάλυσης |
| title_full |
Μελέτη της σύστασης οσφυϊκών σπονδύλων και μηριαίων οστών πειραματόζωων με έλλειψη του γονιδίου ApoE με φασματοσκοπία Raman και τεχνικές στοιχειακής και θερμικής ανάλυσης |
| title_fullStr |
Μελέτη της σύστασης οσφυϊκών σπονδύλων και μηριαίων οστών πειραματόζωων με έλλειψη του γονιδίου ApoE με φασματοσκοπία Raman και τεχνικές στοιχειακής και θερμικής ανάλυσης |
| title_full_unstemmed |
Μελέτη της σύστασης οσφυϊκών σπονδύλων και μηριαίων οστών πειραματόζωων με έλλειψη του γονιδίου ApoE με φασματοσκοπία Raman και τεχνικές στοιχειακής και θερμικής ανάλυσης |
| title_sort |
μελέτη της σύστασης οσφυϊκών σπονδύλων και μηριαίων οστών πειραματόζωων με έλλειψη του γονιδίου apoe με φασματοσκοπία raman και τεχνικές στοιχειακής και θερμικής ανάλυσης |
| publishDate |
2017 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/10653 |
| work_keys_str_mv |
AT nkibalosgeōrgios meletētēssystasēsosphyïkōnspondylōnkaimēriaiōnostōnpeiramatozōōnmeelleipsētougonidiouapoemephasmatoskopiaramankaitechnikesstoicheiakēskaithermikēsanalysēs AT nkibalosgeōrgios studyofcompositionoflumbarvertebraeandfemursoflaboratoryanimalswithlackofgeneapoeusingramanspectroscopyandtechniquesofelementalandthermalanalysis |
| _version_ |
1771297297308581888 |
| spelling |
nemertes-10889-106532022-09-05T20:52:15Z Μελέτη της σύστασης οσφυϊκών σπονδύλων και μηριαίων οστών πειραματόζωων με έλλειψη του γονιδίου ApoE με φασματοσκοπία Raman και τεχνικές στοιχειακής και θερμικής ανάλυσης Study of composition of lumbar vertebrae and femurs of laboratory animals with lack of gene ApoE using Raman spectroscopy and techniques of elemental and thermal analysis Γκίβαλος, Γεώργιος Όρκουλα, Μαλβίνα Κοντογιάννης, Χρίστος Κουτσούκος, Πέτρος Gkivalos, George Γονίδιο ApoE Ποιότητα οστού Οσφυϊκοί σπόνδυλοι Φασματοσκοπία Raman ApoE gene Bone quality Vertebrae Raman spectroscopy 573.76 Το οστό είναι μια φυσική πολύπλοκη ένωση, που ακολουθεί ιεραρχική δόμηση. Αποτελείται από ένα οργανικό και ένα ανόργανο υπόστρωμα, καθώς και από νερό. Σε μοριακό επίπεδο περιλαμβάνει ένα δίκτυο πολυμερικών πρωτεϊνών, κυρίως κολλαγόνο τύπου Ι, και νανοσωματίδια βιοαπατίτη, που ενισχύουν την κολλαγονική δομή, προσφέροντας στην τελευταία αντοχή στη θραύση. Ειδικότερα, μπορεί να αυξήσει ή να μειώσει την αντοχή στη θραύση λόγω εγγενών (λ.χ. γήρανση, μεταβολικές ασθένειες) όσο και εξωγενών μηχανισμών (λ.χ. κατευθυντήριες δυνάμεις). Ιδιότητες του οστού όπως, η σκληρότητα, η πλαστικότητα αναπτύσσονται στην κλιμακούμενη ιεραρχική δόμηση του οστίτη ιστού, η οποία εκτείνεται από την νανοκλίμακα έως την μακροκλίμακα. Τα σκελετικά κατάγματα αποτελούν μια σημαντική ιατρική και οικονομική επιβάρυνση. Μόνο στις ΗΠΑ, τα κατάγματα στο ισχίο, στη σπονδυλική στήλη και στον καρπό αντιπροσώπευαν πάνω από 17 δισεκατομμύρια δολάρια σε άμεσες δαπάνες υγειονομικής περίθαλψης το 2001 και το ετήσιο αυτό κόστος συνεχώς αυξάνεται. Επιπλέον, τα κατάγματα δεν περιορίζονται μόνο στους ηλικιωμένους, αλλά αποτελούν επίσης και ένα σημαντικό πρόβλημα νεότερων ατόμων. H παρούσα μελέτη στοχεύει στη διερεύνηση του ρόλου του γονιδίου ApoE στην ποιότητα των οστών. Για το σκοπό αυτό, μηριαία οστά και σπόνδυλοι μυών με εκτοπισμένο γονίδιο αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν με μάρτυρες. Η κύρια λειτουργία του γονιδίου αυτού είναι ο έλεγχος του μεταβολισμού των λιπιδίων. Επίσης, έχει ευρύτερο ρόλο στην ανοσολογία και στην ανοσορύθμιση. Η χημική σύσταση του οστίτη ιστού είναι ένας σημαντικός παράγοντας, που συνεισφέρει στην ποιότητα του οστού και έχει σημαντική συμβολή στις μηχανικές του ιδιότητες, καθώς και στη χωρική και χρονική συσσώρευση των μικροκαταγμάτων. Η παρατήρηση αυτής ιδιαίτερα σε δομικό επίπεδο διευκολύνεται από την ανάπτυξη βελτιωμένων μέσων ορισμού και μέτρησης της ποιότητας του οστίτη ιστού. Ειδικότερα, φασματοσκοπικές τεχνικές απεικόνισης επιτρέπουν την άμεση παρατήρηση δημιουργίας οστικής ρωγμής και ανάπτυξης αυτής και είναι πολύτιμες για την αποκρυπτογράφηση μηχανισμών επαγωγής θραύσης. Η σύσταση και η ποιότητα του οστίτη ιστού αξιολογήθηκε με τη χρήση της φασματοσκοπίας Raman, μιας μη επεμβατικής τεχνικής, η οποία είναι κατάλληλη για τη μελέτη βιουλικών, διότι επιτρέπει την ταυτόχρονη μελέτη του οργανικού και του ανόργανου συστατικού τους, χωρίς το δείγμα να υποστεί κάποια ιδιαίτερη επεξεργασία. Επίσης η φασματοσκοπία Raman πλεονεκτεί άλλων τεχνικών, καθότι παρέχει τη δυνατότητα ανάλυσης φρέσκων ενυδατωμένων οστών με υψηλή χωρική ανάλυση (όγκοι δείγματος του 1μm3 ή λιγότερο). Η φασματοσκοπία Raman είναι μια δονητική φασματοσκοπική τεχνική, η οποία χρησιμοποιείται για την εκτίμηση του σκεδαζόμενου φωτός βιολογικών μορίων και ιόντων. Η σκέδαση Raman συμβαίνει όταν μόρια εντός του δείγματος διεγείρονται από την προσπίπτουσα ακτινοβολία laser. Λόγω των δονητικών κινήσεων των μορίων, ένα μικρό κλάσμα του φωτός (περίπου 1 στα 107 φωτόνια) χάνει ενέργεια και προκαλεί σκέδαση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας σε μεγαλύτερα μήκη κύματος. Η διαφορά στο μήκος κύματος μεταξύ σκεδαζόμενης και προσπίπτουσας δέσμης φωτός αντιστοιχεί σε μοριακές δονήσεις και οδηγεί σε ζώνες χαρακτηριστικών μετατοπίσεων συχνότητας στο φάσμα Raman. Οι μετατοπίσεις αυτές μετρούνται σε κυματαριθμικές μονάδες (cm-1) και είναι ανάλογες με την ενέργεια δόνησης. Οι μετατοπίσεις συχνότητας χρησιμεύουν στην εκτίμηση της σύνθεσης του οστίτη ιστού. Παράδειγμα αποτελεί η εκτίμηση της ανθρακικής υποκατάστασης στο κρυσταλλικό πλέγμα του βιοαπατίτη (πραγματοποιείται κυρίως υποκατάσταση β-τύπου; Μερική υποκατάσταση των ορθο-φωσφορικών από ανθρακικά ανιόντα). Η εξωκυττάρια μήτρα παρέχει επίσης πληροφόρηση για τη σύνθεση του οστίτη ιστού, δεδομένου του ότι είναι πηγή πλούσια σε δονήσεις πρωτεϊνών, οι οποίες συνιστούν τη δευτεροταγή δομή, όπως εκείνης του αμιδίου και των πλευρικών αμινοξικών αλυσίδων. Η φασματοσκοπία Raman αποδίδει τέσσερις (4) τουλάχιστον σημαντικούς δείκτες της «ποιότητας του οστού», ένας όρος, ο οποίος αναφέρεται στο σύνολο συνθετικών και αρχιτεκτονικών ιδιοτήτων του οστίτη ιστού. Οι δείκτες αυτοί είναι: η αναλογία ανόργανου προς οργανικού συστατικού, η αναλογία ανθρακικών - φωσφορικών ιόντων, η κρυσταλλικότητα και η παράμετρος εκτίμησης της ποιότητας του κολλαγονικού δικτύου. Πραγματοποιήθηκε λήψη πληθώρας φασμάτων Raman στην παρούσα μελέτη. Ειδικότερα, μετρήθηκαν εμβαδά και ύψη, που αντιστοιχούσαν στον αντίστροφο λόγο των εντάσεων της κύριας κορυφής των φωσφορικών, στην αναλογία των εντάσεων της κύριας κορυφής των ανθρακικών και της κύριας κορυφής των φωσφορικών και του λόγου των εντάσεων κορυφών, οι οποίες αποδίδονται στην πρωτεϊνική μήτρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κρυσταλλικότητα και ο δείκτης, που καταδεικνύει το ποσοτό της ασβεστοποίησης της κολλαγονικής μήτρας δεν παρουσιάζουν καμία στατιστικά σημαντική μεταβολή για τις ομάδες των μηριαίων οστών. Για τους οσφυϊκούς σπονδύλους, ο τελευταίος λόγος ήταν αυξημένος για την ομάδα εκείνη που στερούταν το γονίδιο ApoE, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η αναλογία των κορυφών της περιοχής του αμιδίου Ι και ο δείκτης, που εκφράζει το βαθμό της β-υποκατάστασης βρέθηκαν αυξημένοι για την πειραματική ομάδα μηριαίων οστών και οσφυϊκών σπονδύλων, σε σύγκριση με τους μάρτυρες, γεγονός που υποδηλώνει, πως η έλλειψη του γονιδίου ApoE οδηγεί σε μείωση της ελαστικότητας του κολλαγονικού δικτύου και της ακαμψίας και επομένως σε αυξημένη ευθραυστότητα του οστού. H φασματοσκοπική ανάλυση των πειραματόζωων με την τεχνική Raman έδειξε πως, οι οσφυϊκοί σπόνδυλοι εμφανίζουν σοβαρότερη υποβάθμιση του κολλαγονικού τους δικτύου και μειωμένη οστική αντοχή σε σχέση με τα μηριαία οστά, η οποία δύναται να οφείλεται στην μειωμένη των τελευταίων σε σχέση με τους πρώτους οστική αναδόμηση. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε η επεμβατική αναλυτική τεχνική ΑΑS (φασματοσκοπία ατομικής απορρόφησης), για τη μέτρηση της περιεκτικότητας των οσφυϊκών σπονδύλων σε ασβέστιο. Η φασματομετρική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα ασβεστίου (διαδικασία του εμβολιασμού) και 2.5% La2O3 για την ελαχιστοποίηση φασματικών και χημικών παρεμποδίσεων της μήτρας διαλυμάτων βιοαπατίτη, που απομονώθηκαν από το κολλαγόνο χρησιμοποιώντας HNO3 0.5 N (όξινη πέψη). Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε μελέτη της περιεκτικότητας των οσφυϊκών σπονδύλων σε κολλαγόνο, χρησιμοποιώντας την αναλυτική τεχνική TGA (θερμοσταθμική ανάλυση). Η τελευταία χρησιμοποιείται για την εκτίμηση του οργανικού περιεχομένου του οστού. Ιδιαίτερα, η καμπύλη της πρώτης παραγώγου του θερμογραφήματος επιτρέπει τον προσδιορισμό της απώλειας οστικής οργανικής μάζας. To βασικό συμπέρασμα που εξήχθη, ήταν η μειωμένη περιεκτικότητα σε κολλαγόνο των -/- ApoE σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου των συγκεκριμένων δειγμάτων. Φασματομετρία ατομικής απορρόφησης, σε συνδυασμό με την καταστροφική για τα δείγματα αναλυτική τεχνική TGA χρησιμοποιήθηκαν για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων Raman και ιδίως για τον έλεγχο του λόγου MMR (εκφράζει τη σχετική ποσοτική αναλογία ανόργανου - οργανικού τμήματος του οστίτη ιστού). Τέλος, χρησιμοποιήθηκε η αναλυτική τεχνική ΤXRF (φθορισμός ακτίνων Χ με ολική ανάκλαση), για την εκτίμηση της περιεκτικότητας του οστού σε ασβέστιο και σε φωσφόρο, για την επίγνωση της δομικής σύνθεσης του βιοαπατίτη και για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της AAS. Δύναται να πραγματοποιηθούν ποικίλες υποκαταστάσεις στο κρυσταλλικό πλέγμα του βιοπατίτη τόσο στην κατιοντική θέση του ασβεστίου όσο και στην ανιοντική πλευρά των φωσφορικών ιόντων. Οι υποκαταστάσεις αυτές είναι δυνατόν να επηρεάσουν τις φυσικοχημικές ιδιότητες του οστίτη ιστού, όπως τη διαλυτότητα, την πυκνότητα, τη σκληρότητα και την μορφολογία οστικής ανάπτυξης. Η σύνθεση των οστών έχει δειχθεί, ότι μεταβάλλεται με την ηλικία και πως επηρεάζεται από μεταβολικές διαταραχές και θεραπευτικές αγωγές. Bone is a natural composite material, consisting of organic, mineral and water assembled in the form of a complex hierarchical structure. At the molecular level, it comprises a network of polymeric proteins, primarily type I collagen, with hard and stiff mineral nanoparticles of bioapatite that reinforce it. Specifically, bone derives its toughness and hence its ability to resist fracture from both intrinsic (e.g. aging and disease) and extrinsic mechanisms (e.g. mechanical loading). The stiffness, strength, plasticity and toughness properties of bone develop from this multi-scaled hierarchical structure, which spans from nanometer to macroscopic dimensions. Skeletal fracture represents a significant medical and economic burden. In US alone, age-related hip, spine and wrist fractures accounted for more than $17 billion in direct health care costs in 2001 and this annual cost is rising. Moreover, skeletal fractures are not limited to the elderly-stress fractures and impact/trauma-related fractures are a clinically significant problem in younger people also. The scope of the current study was to investigate the role of ApoE gene in bone quality. The main function of ApoE is to participate in lipid metabolism and has a wider role in immunology and immunomodulation. For this purpose femoral and vertebrae from ApoE deficient mice were compared to healthy controls. Insight into failure mechanisms of bone, particularly at the ultrastructural-level, is facilitated by the development of improved means of defining and measuring tissue quality. In particular spectroscopic imaging techniques allow for a direct observation of crack initiation and growth and are valuable for deciphering incipient mechanisms of failure. Bone composition and quality was evaluated employing Raman spectroscopy, a noninvasive analytical technique which is particularly suited to biomaterials since it enables the organic and mineral component to be studied simultaneously, without sample preparation. Other advantages of Raman spectroscopy include its applicability to fresh hydrated bone specimens and the high spatial resolution (with sampling volumes of 1 μm3 or less). Raman spectroscopy is a vibrational spectroscopy technique used to assess scattered light from biologic molecules and ions. Raman scattering occurs, when molecules within a specimen are excited by incident laser light. Vibrational motions within the molecules lead to a small fraction of the light (approximately one in 107 photons) losing energy and being scattered at longer wavelengths. The wavelength difference between scattered and incident light corresponds to molecular vibrations and yielding bands at characteristic frequency shifts in the Raman spectrum. These shifts are measured in wavenumbers corresponding to the vibrational energy (cm-1). Frequency shifts serve as an important source of contrast in assessing tissue composition such as carbonate ion substitutions for phosphate positions in bone. The extracellular matrix also provides another source of contrast to bone tissue composition, as it contains many protein-rich vibrational modes, corresponding predominantly to collagen features such as amide Ι, protein secondary structure and side chain composition. Raman spectroscopy yields at least four important composition measures which are components of “bone quality”, a term refering to the ensemble of composition and architectural properties of bone tissue that together determine its material properties and its ability to perform its mechanical functions. The parameters of bone quality are: mineral to matrix ratio, carbonate to phosphate ratio, mineral crystallinity and the collagen quality parameter. Several Raman spectra were acquired from the samples tested in the present work and the intensities of the primary phosphate band at 959 cm-1 and 1072 cm-1 for the carbonate of the mineral, the matrix bands at 855 cm-1 (proline), 877 cm-1 (hydroxyproline) and 920 cm-1 (proline), as well as the major sub-bands under amide I envelope (1590-1710 cm-1) were measured. Both peak heights and areas under the peaks were measured. The mineral crystallinity and the mineral to matrix ratio showed no statistically significant variation for the femur groups, while for the vertebrae groups the latter ratio showed an increase for the ApoE gene shortage group compare to the control one. On the other hand, band ratio of 1660 cm-1/ 1690 cm-1 (cross-linking ratio) in the amide I spectral area and the CPR (carbonate to phosphate ratio) were increased for the experimental group of gene deficiency compared to the control, suggesting that ApoE gene shortage leads to reduction of network elasticity and mineral stiffness and thus to increased bone fragility. Raman analysis of animal models showed that only collagen cross-linking formation and mineral quality, with regard to bone structure, is gene controlled while mineralization remains unaffected. Furthermore, lumbar vertebrae exhibit severe degradation of the collagen network and decrease of the respective of bone strength in comparison with the femurs. Atomic absorption spectroscopy, a sample destructive analytical technique, was used for the measurement of calcium content of the test specimens. Bioapatite was isolated from collagen by using HNO3 0.5N. Next, the study of collagen content was done using TGA (thermogravimetric analysis). The 1st derivative was used to delimit the mass loss occurs with rising temperature. The rest of mass corresponding to BAP (bioapatite) content. The main result was that the content of collagen of ApoE deficiency specimens was lower than the respective of the control specimens. AAS combination with TGA were used for the verification of Raman results and in particular for the control of MMR (mineral to matrix ratio). Finally, TXRF (Total Reflection X-ray Fluorescence) was used for the measurement of the mineral content, in order to identify the inorganic components of bioapatite. The exact composition of the apatite mineral is not well defined because of substitutions of various anions into the mineral apatite lattice both for calcium and for phosphate. Ionic substitutions can affect bone’s chemical and physical properties such as solubility, density, hardness, and growth morphology. Bone composition has been shown to change with age and is also affected by diseases and by modifications used for the corresponding threatment. 2017-08-25T07:01:49Z 2017-08-25T07:01:49Z 2017-06-21 Thesis http://hdl.handle.net/10889/10653 gr 0 application/pdf |
