| Περίληψη: | Οι νοθείες των τροφίμων και συγκεκριμένα οι νοθείες του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων με τις οποίες θα ασχοληθούμε στην παρούσα εργασία, θεωρούνται ως ένα από τα σημαντικότερα ζητήματα που καλείται να αντιμετωπίσει σήμερα το καταναλωτικό κοινό υπερασπιζόμενο το αναυθαίρετο δικαίωμα του για ακριβή γνώση της σύστασης των προϊόντων που εισέρχονται στο τραπέζι του. Τα τελευταία χρόνια, το δικαίωμα αυτό, κυρίως λόγω της αυξανόμενης ζήτησης αυτής της κατηγορίας τροφίμων, καθώς το γάλα και γενικότερα τα γαλακτοκομικά προϊόντα θωερούνται από τα πιο ωφέλιμα και απαραίτητα συστατικά μιας ισορροπημένης και υγειούς διατροφής, παραβιάζεται από τις βιομηχανίες παραγωγής και τις μονάδες επεξεργασίας τροφίμων με μόνο κίνητρο την αύξηση του κέρδους. Για αυτό το λόγο κρίνεται πλέον επιτακτική η ανάγκη ανάπτυξης γρήγορων, ευαίσθητων και αξιόπιστων αναλυτικών τεχνικών για την ανίχνευση της νοθείας του γάλακτος.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία αναπτύσσονται δύο μέθοδοι, μια χημειοφωταυγειομετρική και μία φθορισμομετρική, για την ανίχνευση των διαφόρων ειδών γάλακτος. Και οι δύο αυτές μέθοδοι βασίζονται στην ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών DNA των τριών βασικών ειδών γάλακτος, δηλ. πρόβειου, αγελαδινού και κατσικίσιου, τόσο όταν αυτά βρίσκονται μεμονωμένα, όσο και υπό τη μορφή μιγμάτων μεταξύ τους. Η πρόκληση των τεχνικών αυτών είναι η ανίχνευση εξαιρετικά μικρών συγεντρώσεων συγκεκριμένων αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων ανάμεσα σε ένα πολύ μεγάλο αριθμό διαφορετικών αλληλουχιών ολόκληρου του γενωμικού υλικού. Πρωταρχικό στάδιο και των δύο μεθόδων είναι ο in vitro πολλαπλασιασμός συγκεκριμένης προς ανάλυση αλληλουχίας DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction).
Η πρώτη μέθοδος η οποία αναπτύχθηκε είναι μία χημειοφωταυγειομετρική μέθοδος ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων μέσω δοκιμασιών υβριδοποίησης, σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης δηλ. σε διακριτές επιφάνειες πολυστυρενίου. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται στη συμπληρωματικότητα μεταξύ των βάσεων του DNA, στην εκλεκτική αντίδραση μεταξύ ενζύμου-υποστρώματος ή αντιγόνου-αντισώματος και στην εκπομπή χημειοφωταύγειας. Τα προϊόντα PCR που χρησιμοποιούνται στη δοκιμασία είναι κατάλληλα επισημασμένα, ώστε να καθίσταται δυνατή η ανίχνευση τους, ενώ η ένταση της παραγόμενης χημειοφωταύγειας είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ειδικής αλληλουχίας-στόχου. Η μέθοδος εφαρμόστηκε επιτυχώς στην ανίχνευση και των τριών ειδών γάλακτος με όριο ανίχνευσης ίσο με 1,4 pM. Επιπλέον, με σκοπό τον έλεγχο νοθείας πραγματοποιήθηκε ανίχνευση προσμίξεων αγελαδινού γάλακτος σε πρόβειο και κατσικίσιο σε χαμηλό ποσοστό ίσο με 0,01%.
Η δεύτερη μέθοδος την οποία αναπτύξαμε είναι μια φθορισμομετρική μέθοδος ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων, μέσω δοκιμασιών υβριδοποίησης σε εναιώρημα φασματικά διακριτών μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου στο εσωτερικό των οποίων περιέχονται δύο φθορίζουσες χρωστικές σε συγκεκριμένη αναλογία, έτσι ώστε κάθε σφαιρίδιο να είναι μοναδικό. Τα βασικά στάδια της μεθόδου αυτής είναι η ομοιοπολική πρόσδεση ειδικών ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών στην επιφάνεια των μικροσφαιριδίων και η υβριδοποιήση τους με τις αντίστοιχες αλληλουχίες DNA-στόχους. Τα υβρίδια που προκύπτουν ανιχνεύονται μέσω του συζεύγματος στρεπταβιδίνης-φυκοερυθρίνης με χρήση κυτταρομετρητή ροής όπου η ένταση του εκπεμπόμενου φθορισμού είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του προϊόντος PCR. Με επιτυχία ανιχνεύθηκαν και τα τρία εξεταζόμενα είδη γάλακτος με όριο ανίχνευσης 1,4 pM, ενώ κατέστη δυνατή και η ανίχνευση προσμίξεων αγελαδινού γάλακτος σε πρόβειο και κατσικίσιο σε χαμηλό ποσοστό ίσο με 0,01%.
|
|---|
