Ο ρόλος του παράγοντα Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης λεμφοτροπικών μεταγραφικών παραγόντων

• Κύριος συγγραφέας: Δάβουλου, Παναγιώτα
• Άλλοι συγγραφείς: Μουζάκη, Αθανασία
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2018
• Θέματα: Λεμφοτροπικοί παράγοντες; Μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων; Ets-2; Lymphotropic factors; 572.8

O μεταγραφικός παράγοντας Ets-2 είναι μέλος της οικογένειας Εts, μιας οικογένειας συντηρημένων γονιδίων, που συμμετέχουν στη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων και εμπλέκονται σε βασικές βιολογικές διεργασίες, oι οποίες περιλαμβάνουν τη μίτωση, την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και τη ρύθμιση της ανοσίας. O λόγος που μας οδήγησε στη μελέτη του παράγοντα Εts-2 προκύπτει από πειράματα του εργαστηρίου μας που απέδειξαν την κατασταλτική δράση του Εts-2 στην έκφραση του γονιδίου της IL-2 στα παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα. Ωστόσο ο ακριβής μηχανισμός μέσω του οποίου ασκείται η κατασταλτική αυτή δράση παραμένει υπό διερεύνηση. Για το λόγο αυτό, σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν η μελέτη του ρόλου που έχει ο παράγοντας Ets-2 στη ρύθμιση της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων NFAT2, NF-κΒ p65, c-Jun και της κινάσης CDK10, οι οποίοι αποτελούν κομβικούς παράγοντες που ελέγχουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των Τ και Β κυττάρων. Αρχικά ελέγχθηκαν τα επίπεδα σύνθεσης του ets-2 mRNA στις ανθρώπινες Τ λεμφοκυτταρικές σειρές Jurkat και Η938, στις ανθρώπινες Β λεμφοκυτταρικές σειρές U266, HS-Sultan, Raji, IM9 και RPMI και στην ανθρώπινη νεφρική εμβρυϊκή κυτταρική σειρά ΗΕΚ 293. Yψηλότερα επίπεδα παρουσιάστηκαν στις κυτταρικές σειρές Jurkat, H938 και ΗΕΚ 293. Για τους παραπάνω λόγους χρησιμοποιήθηκαν οι ανωτέρω κυτταρικές σειρές για την πραγματοποίηση των πειραμάτων. Συγκεκριμένα, προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος του παράγοντα Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης των υπό μελέτη παραγόντων, πραγματοποιήθηκαν πειράματα διαμόλυνσης των κυτταρικών σειρών με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου υπερέκφρασης του Εts-2 (pCDNA-ets2). Tα κύτταρα καλλιεργήθηκαν απουσία (CM) ή παρουσία μιτογόνων (εστέρα φορβόλης και ιονομυκίνης, P/I). Για να εξακριβωθεί η υπερέκφραση του ets-2 σε μεταγραφικό επίπεδο, απομονώθηκε RNA απο τα κύτταρα και ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του ets-2 με PCR. Σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των κυττάρων, με ανάλυση western blotting αρχικά ελέγχθηκε η υπερέκφραση του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο και ακολούθως με τη χρήση κατάλληλων αντισωμάτων διερευνήθηκε η επίδρασή της στην έκφραση των υπό μελέτη παραγόντων. Αναλύοντας τα αποτελέσματα που προέκυψαν, παρατηρήθηκε ότι η υπερέκφραση του Εts-2 στις κυτταρικές σειρές Jurkat και Η938, επέφερε αύξηση της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων NFAT2, ΝF-κΒ p65 και c-Jun, τόσο στα 8 κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM όσο και στα κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν. Αντιθέτως στην κυτταρική σειρά ΗΕΚ, σε ενεργοποιημένα κύτταρα, η υπερέκφραση του Ets-2 οδήγησε σε μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης c-Jun, ενώ σε μη ενεργοποιημένα κύτταρα οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της c-Jun. Επίσης, στην κυτταρική σειρά H938, σε συνθήκες CM, oι αυξανόμενες ποσότητες του pcDNA-ets2 προκάλεσαν μείωση των επιπέδων της CDK10, ενώ προκάλεσαν αύξηση των επιπέδων της CDK10 στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Aντιθέτως στην κυτταρική σειρά ΗΕΚ, σε συνθήκες CM, η υπερέκφραση του Εts-2 οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα της CDK10, σε αντίθεση με τα μειωμένα επίπεδα που παρατηρήθηκαν στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, συμπεραίνουμε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Εts-2 εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης κομβικών λεμφοτροπικών παραγόντων. Συγκεκριμένα, από την ανάλυση των αποτελεσμάτων παρατηρείται ότι στις κυτταρικές σειρές Jurkat και Η938, ο Εts-2 ασκεί θετική ρύθμιση στην έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων ΝFAT2, NF-κΒ p65 και c-Jun. Επίσης, ο Εts-2 ασκεί θετική ρύθμιση στην έκφραση της CDK10 στα ΗΕΚ κύτταρα σε συνθήκες CM και στα Η938 κύτταρα σε συνθήκες P/I. Ωστόσο, τα αποτελέσματά θέτουν τη βάση περαιτέρω μελετών για τη διερεύνηση του ρόλου του Ets-2 στη ρύθμιση σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των Τ και Β κυττάρων.