Λειτουργική ανάλυση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου Coup-tf στο έμβρυο του αχινού

• Κύριος συγγραφέας: Καλαμπόκη, Λαμπρινή
• Άλλοι συγγραφείς: Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2008
• Θέματα: Αχινοί; Γονίδιο Coup-tf; Sea urchins; Coup-tf gene; 593.95

Tο γονίδιο COUP-TF κωδικοποιεί έναν ορφανό υποδοχέα ο οποίος δρα ως μεταγραφικός παράγοντας και ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων των στεροειδών/ θυρεοειδών ορμονών. Στον αχινό το γονίδιο COUP-TF εκφράζεται στο στοματικό έξώδερμα στο αναπτυξιακό στάδιο του γαστριδίου και στη βλεφαριδωτή ζώνη στο στάδιο του πλουτέα. Aργότερα κατά την ανάπτυξη της νύμφης εκφράζεται αποκλειστικά στα νευρικά κύτταρα και στον ενήλικα αχινό στις ωοθήκες, σε μυικά κύτταρα και άλλους ιστούς (Chan et.al. 1992). Στόχος των συγκεκριμένων πειραμάτων είναι η μελέτη της ρύθμισης του γονιδίου COUPTF στα αναπτυξιακά στάδια του γαστριδίου και του πλουτέα. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μια λεπτομερής ανάλυση της ανοδικής περιοχής του γονιδίου COUP-TF με σκοπό να καθοριστούν τα ιστοειδικά και χρονοειδικά στοιχεία που επηρεάζουν τη ρύθμιση. Προς το σκοπό αυτό αναγνωρίστηκε το σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου. Kατόπιν, απομονώθηκε ανοδική περιοχή μεγέθους 2kb περίπου, από το +14 έως το -1930. Tο τμήμα αυτό κλωνοποιήθηκε σε φορέα που φέρει το γονίδιο αναφοράς GFP, καθώς και το βασικό υποκινητή του γονιδίου Endo16. Από το αρχικό αυτό κατασκεύασμα, δημιουργήθηκαν διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα της περιοχής αυτής με τη μέθοδο της PCR. Eπιπλέον απομονώθηκαν επιμέρους μικρά ανοδικά τμήματα που δεν περιείχαν το βασικό υποκινητή του COUP-TF και κλωνοποιήθηκαν και αυτά στον ίδιο φορέα. Όλα τα κατασκευάσματα ενέθηκαν σε γονιμοποιημένα αυγά αχινού και μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης GFP στα στάδια του γαστριδίου και του πλουτέα. Tα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πρώτες 1079 βάσεις ανοδικά του +1 φέρουν τα απαραίτητα ρυθμιστικά στοιχεία για την έκφραση του COUP-TF στο στοματικό εξώδερμα και στο μεσέγχυμα. Eπιπλέον, η περιοχή από -232 έως -532 περιέχει έναν ενισχυτή της έκφρασης του COUP-TF στο στοματικό εξώδερμα ενώ το τμήμα από -1398 έως - 1639 έναν ενισχυτή της έκφρασης στο μεσέγχυμα. Ανοδικά του -1639 έως το -1930 περιέχεται ένας ισχυρός καταστολέας για την έκφραση του COUP-TF στο στοματικό εξώδερμα. Tα αποτελέσματα των ενέσεων με τα μικρά ανοδικά τμήματα επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματα με τα διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα και αναδεικνύουν ότι τα ρυθμιστικά στοιχεία που είναι απαραίτητα για την έκφραση του γονιδίου στο στοματικό εξώδερμα βρίσκονται στο τμήμα μεταξύ -232 και -1079. Η μελέτη ολόκληρης της ανοδικής περιοχής (έως -1930) δεν αναγνώρισε κάποιο τμήμα το οποίο να καταστέλλει την εκτοπική έκφραση του γονιδίου αναφοράς στα 7 μεσεγχυματικά κύτταρα. Η πραγματοποίηση κατασκευασμάτων που περιείχαν εκτός της ανοδικής περιοχής και την 5΄μη μεταφραζόμενη περιοχή οδήγησαν σε καταστολή της έκφρασης της GFP σε όλες τις κυτταρικές γραμμές. Η ανεύρεση στην 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή ενός στοιχείου απόκρισης για τον COUP-TF μας οδηγεί στην υπόθεση της πιθανής αυτορρύθμισης και συγκεκριμένα της αυτοκαταστολής του COUP-TF.