Παραγωγή και δομικός χαρακτηρισμός ιικών πρωτεϊνών και νέων πολυμόρφων ινσουλίνης
Στην παρούσα διπλωματική εργασία ειδικές τεχνικές που αφορούν δύο ιικές πρωτεΐνες, την πρωτεάση 3C του ιού Coxsackie B3 και την περιοχή μεθυλτρανσφεράσης της πρωτεΐνης NS5 του ιού Dengue 3 πραγματοποιήθηκαν, όπως η απομόνωση, η κρυστάλλωση και ο αρχικός δομικός χαρακτηρισμός μέσω της ανάλυσης XRPD....
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2018
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/11183 |
| id |
nemertes-10889-11183 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Πρωτεϊνική έκφραση Δομικός χαρακτηρισμός Ιικές πρωτεΐνες XRPD ανάλυση Protein expression Structural characterization Viral proteins XRPD analysis 616.910 1 |
| spellingShingle |
Πρωτεϊνική έκφραση Δομικός χαρακτηρισμός Ιικές πρωτεΐνες XRPD ανάλυση Protein expression Structural characterization Viral proteins XRPD analysis 616.910 1 Χριστοπούλου, Μαγδαληνή Παραγωγή και δομικός χαρακτηρισμός ιικών πρωτεϊνών και νέων πολυμόρφων ινσουλίνης |
| description |
Στην παρούσα διπλωματική εργασία ειδικές τεχνικές που αφορούν δύο ιικές πρωτεΐνες, την πρωτεάση 3C του ιού Coxsackie B3 και την περιοχή μεθυλτρανσφεράσης της πρωτεΐνης NS5 του ιού Dengue 3 πραγματοποιήθηκαν, όπως η απομόνωση, η κρυστάλλωση και ο αρχικός δομικός χαρακτηρισμός μέσω της ανάλυσης XRPD. Επιπλέον, διεξήχθη μελέτη για την επίδραση του οργανικού προσδέτη 4-χλωρορεσορσινόλη στη δομή της ανθρώπινης ινσουλίνης, μέσω περίθλασης ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικό υλικό (XRPD).
Μοριακές τεχνικές, όπως ο μετασχηματισμός και η καλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων, η αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση και η χρωματογραφία FPLC χρησιμοποιήθηκαν για την έκφραση και την απομόνωση των δύο ιικών πρωτεϊνών. Η διεργασία κρυστάλλωσης διεξήχθη σε ένα εύρος pH, μέσω της μεθόδου Batch. Τα πολυκρυσταλλικά ιζήματα που σχηματίστηκαν, χρησιμοποιήθηκαν αργότερα για μετρήσεις XRPD χρησιμοποιώντας εργαστηριακές υποδομές και ακτινοβολία Synchrotron. Η ανάλυση δεδομένων αποκάλυψε ότι οι κρύσταλλοι της πρωτεάσης 3C ανήκουν σε μονοκλινή συμμετρία, ενώ οι κρύσταλλοι του τομέα μεθυλτρανσφεράσης ανήκουν στην ορθορομβική συμμετρία. Αυτά είναι προκαταρκτικά βήματα προς τον επιτυχή προσδιορισμό της δομής αυτών των ιικών πρωτεϊνών, καθώς και τον προσδιορισμό των μορίων που προσδένονται σε αυτές. Το τελευταίο θα ενισχύσει τη διαδικασία παραγωγής στοχευμένων φαρμάκων έναντι δύο σημαντικών ιών που αναμένεται να προκαλέσουν επιδημίες στο μέλλον.
Σε συνέχεια προηγούμενων μελετών σχετικά με την ανθρώπινη ινσουλίνη από την ομάδα μας, ερευνήσαμε την επίδραση του προσδέτη 4-χλωρορεσορσινόλη σε δομικά μοτίβα ανθρώπινης ινσουλίνης, που συμπλέκονται με τον προσδέτη. Πειράματα κρυστάλλωσης διεξήχθησαν υπό συστηματική μεταβολή του pH, παρουσία ιόντων ψευδαργύρου. Ακολούθως, τα πολυκρυσταλλικά ιζήματα, τα οποία σχηματίστηκαν, χρησιμοποιήθηκαν για μετρήσεις XRPD. Τέσσερα διαφορετικά πολύμορφα ινσουλίνης εντοπίστηκαν από την ανάλυση δεδομένων. Τέλος, παράγονται και χαρακτηρίζονται τέσσερις διαφορετικές κρυσταλλικές φάσεις μονοκλινούς συμμετρίας, μείζονος φαρμακευτικού ενδιαφέροντος.
Ο κύριος σκοπός αυτής της έρευνας είναι να υπογραμμίσει τη σημασία της ανάλυσης XRPD ως πολύτιμου ερευνητικού εργαλείου σε επιστημονικούς τομείς, όπως η ιολογία, ο σχεδιασμός δομών φαρμάκων και η δομική βιολογία. |
| author2 |
Μαργιωλάκη, Ειρήνη |
| author_facet |
Μαργιωλάκη, Ειρήνη Χριστοπούλου, Μαγδαληνή |
| format |
Thesis |
| author |
Χριστοπούλου, Μαγδαληνή |
| author_sort |
Χριστοπούλου, Μαγδαληνή |
| title |
Παραγωγή και δομικός χαρακτηρισμός ιικών πρωτεϊνών και νέων πολυμόρφων ινσουλίνης |
| title_short |
Παραγωγή και δομικός χαρακτηρισμός ιικών πρωτεϊνών και νέων πολυμόρφων ινσουλίνης |
| title_full |
Παραγωγή και δομικός χαρακτηρισμός ιικών πρωτεϊνών και νέων πολυμόρφων ινσουλίνης |
| title_fullStr |
Παραγωγή και δομικός χαρακτηρισμός ιικών πρωτεϊνών και νέων πολυμόρφων ινσουλίνης |
| title_full_unstemmed |
Παραγωγή και δομικός χαρακτηρισμός ιικών πρωτεϊνών και νέων πολυμόρφων ινσουλίνης |
| title_sort |
παραγωγή και δομικός χαρακτηρισμός ιικών πρωτεϊνών και νέων πολυμόρφων ινσουλίνης |
| publishDate |
2018 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/11183 |
| work_keys_str_mv |
AT christopouloumagdalēnē paragōgēkaidomikoscharaktērismosiikōnprōteïnōnkaineōnpolymorphōninsoulinēs AT christopouloumagdalēnē productionandstructuralcharactirizationofviralproteinsandnovelpolymorphsofinsulin |
| _version_ |
1771297334309683200 |
| spelling |
nemertes-10889-111832022-09-05T20:43:24Z Παραγωγή και δομικός χαρακτηρισμός ιικών πρωτεϊνών και νέων πολυμόρφων ινσουλίνης Production and structural charactirization of viral proteins and novel polymorphs of insulin Χριστοπούλου, Μαγδαληνή Μαργιωλάκη, Ειρήνη Γεωργίου, Χρήστος Ροσμαράκη, Ελευθερία Christopoulou, Magdalini Πρωτεϊνική έκφραση Δομικός χαρακτηρισμός Ιικές πρωτεΐνες XRPD ανάλυση Protein expression Structural characterization Viral proteins XRPD analysis 616.910 1 Στην παρούσα διπλωματική εργασία ειδικές τεχνικές που αφορούν δύο ιικές πρωτεΐνες, την πρωτεάση 3C του ιού Coxsackie B3 και την περιοχή μεθυλτρανσφεράσης της πρωτεΐνης NS5 του ιού Dengue 3 πραγματοποιήθηκαν, όπως η απομόνωση, η κρυστάλλωση και ο αρχικός δομικός χαρακτηρισμός μέσω της ανάλυσης XRPD. Επιπλέον, διεξήχθη μελέτη για την επίδραση του οργανικού προσδέτη 4-χλωρορεσορσινόλη στη δομή της ανθρώπινης ινσουλίνης, μέσω περίθλασης ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικό υλικό (XRPD). Μοριακές τεχνικές, όπως ο μετασχηματισμός και η καλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων, η αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση και η χρωματογραφία FPLC χρησιμοποιήθηκαν για την έκφραση και την απομόνωση των δύο ιικών πρωτεϊνών. Η διεργασία κρυστάλλωσης διεξήχθη σε ένα εύρος pH, μέσω της μεθόδου Batch. Τα πολυκρυσταλλικά ιζήματα που σχηματίστηκαν, χρησιμοποιήθηκαν αργότερα για μετρήσεις XRPD χρησιμοποιώντας εργαστηριακές υποδομές και ακτινοβολία Synchrotron. Η ανάλυση δεδομένων αποκάλυψε ότι οι κρύσταλλοι της πρωτεάσης 3C ανήκουν σε μονοκλινή συμμετρία, ενώ οι κρύσταλλοι του τομέα μεθυλτρανσφεράσης ανήκουν στην ορθορομβική συμμετρία. Αυτά είναι προκαταρκτικά βήματα προς τον επιτυχή προσδιορισμό της δομής αυτών των ιικών πρωτεϊνών, καθώς και τον προσδιορισμό των μορίων που προσδένονται σε αυτές. Το τελευταίο θα ενισχύσει τη διαδικασία παραγωγής στοχευμένων φαρμάκων έναντι δύο σημαντικών ιών που αναμένεται να προκαλέσουν επιδημίες στο μέλλον. Σε συνέχεια προηγούμενων μελετών σχετικά με την ανθρώπινη ινσουλίνη από την ομάδα μας, ερευνήσαμε την επίδραση του προσδέτη 4-χλωρορεσορσινόλη σε δομικά μοτίβα ανθρώπινης ινσουλίνης, που συμπλέκονται με τον προσδέτη. Πειράματα κρυστάλλωσης διεξήχθησαν υπό συστηματική μεταβολή του pH, παρουσία ιόντων ψευδαργύρου. Ακολούθως, τα πολυκρυσταλλικά ιζήματα, τα οποία σχηματίστηκαν, χρησιμοποιήθηκαν για μετρήσεις XRPD. Τέσσερα διαφορετικά πολύμορφα ινσουλίνης εντοπίστηκαν από την ανάλυση δεδομένων. Τέλος, παράγονται και χαρακτηρίζονται τέσσερις διαφορετικές κρυσταλλικές φάσεις μονοκλινούς συμμετρίας, μείζονος φαρμακευτικού ενδιαφέροντος. Ο κύριος σκοπός αυτής της έρευνας είναι να υπογραμμίσει τη σημασία της ανάλυσης XRPD ως πολύτιμου ερευνητικού εργαλείου σε επιστημονικούς τομείς, όπως η ιολογία, ο σχεδιασμός δομών φαρμάκων και η δομική βιολογία. In this present diploma thesis, specific techniques concerning the two virus proteins, the protease 3C of Coxsackie virus B3 and the methyltransferase domain of NS5 protein of Dengue virus 3, took place, such as isolation, crystallization and initial structural characterization via XRPD analysis. In addition, a study on the effect of the organic ligand 4-chlororesorcinol on the structure of human insulin has been conducted, via X-ray Powder Diffraction (XRPD) analysis. Molecular techniques, such as transformation and culture of bacterial cells, denaturing gel electrophoresis and FPLC chromatography, were used to express and isolate the two virus proteins. The crystallization process was conducted in a pH range, via the Batch method. The polycrystalline precipitates formed, were later employed for XRPD measurements using laboratory infrastructures and synchrotron radiation. Data analysis revealed that the protease 3C crystals belong to monoclinic symmetry, while the crystals of the methyltransferase domain belong to orthorhombic symmetry. These are preliminary steps towards the successful structure determination of these virus proteins, as well as determining their binding molecules. The latter will enhance the process of producing targeted drugs against two major viruses which are expected to cause epidemias in the future. In continuation of earlier studies on human insulin by our team, we investigated the effects of the ligand 4-chlororesorcinol on human insulin structural motifs complexed with the ligand. Crystallization experiments were carried out under systematic pH variation, in the presence of zinc ions. Subsequently, the polycrystalline precipitates, which were formed, were used for XRPD measurements. Four different insulin polymorphs were identified from data analysis. Finally, four distinct crystalline phases of monoclinic symmetry, of major pharmaceutical interest, were produced and characterized. The main purpose of this research is to highlight the importance of the XRPD analysis as a valuable research tool in scientific fields, such as Virology, structure based drug design and structural biology. 2018-04-12T06:24:25Z 2018-04-12T06:24:25Z 2017-09-26 Thesis http://hdl.handle.net/10889/11183 gr 6 application/pdf |
