| Περίληψη: | Οι φωταυγάζουσες πρωτεΐνες και τα φθορίζοντα νανοσωματίδια αποτελούν αντικείμενα έντονης ερευνητικής δραστηριότητας τα τελευταία χρόνια γιατί έχουν εισαχθεί ως νέοι ιχνηθέτες στις σύγχρονες μεθόδους χημικής ανάλυσης. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια επίσης χρησιμοποιούνται σε πληθώρα αναλυτικών μεθόδων για τον ταχύ και απλό διαχωρισμό μορίων από διάλυμα με τη βοήθεια μαγνητικού πεδίου. Αντικείμενο της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας είναι η πειραματική μελέτη διαφόρων μεθόδων παρασκευής φωτοπρωτεϊνών και νανοσωματιδίων.
Συγκεκριμένα η εργασία πραγματεύεται τα εξής:
(A) Υπερέκφραση, απομόνωση και καθαρισμό ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης σε βακτήρια. Αρχικά υπερεκφράζεται η αποπρωτεΐνη αποαικουορίνη σε E. coli χρησιμοποιώντας πλασμιδιακό φορέα, ο οποίος φέρει το πεπτίδιο οδηγό της πρωτεΐνης Α έτσι ώστε η αποαικουορίνη μετά τη σύνθεσή της να οδηγείται στον περιπλασμικό χώρο του κυττάρου. Ακολουθεί απομόνωση της αποαικουορίνης με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου, συμπλοκοποίηση (ενεργοποίηση) με σελεντεραζίνη και καθαρισμός της ενεργής αικουορίνης με χρωματογραφία υδρόφοβων ομάδων. Η ενεργότητα της αικουορίνης προσδιορίζεται με βάση την ένταση της εκπεμπόμενης βιοφωταύγειας μετά από προσθήκη ιόντων Ca2+. Η απόδοση της μεθόδου είναι 4 φορές μεγαλύτερη από προηγούμενη μέθοδο που περιλάμβανε έκφραση της αποαικουορίνης στο κυτταρόπλασμα, διαλυτοποίηση των σχηματιζόμενων συσσωματωμάτων εγκλεισμού και χρωματογραφικό διαχωρισμό.
(B) Παρασκευή φθοριζόντων ημιαγώγιμων νανοκρυστάλλων (κβαντικές τελείες, quantum dots, QDs). Μελετήθηκαν μέθοδοι σύνθεσης QDs είτε σε οργανικούς διαλύτες ή σε υδατικό περιβάλλον με έμφαση την παρασκευή τους σε υδατικά διαλύματα γιατί είναι συμβατά με τις συνθήκες ανάλυσης βιομορίων. Παρουσιάζεται η σύνθεση κβαντικών τελειών CdSe σε οργανικούς διαλύτες και η σύνθεση κβαντικών τελειών CdS σταθεροποιημένων με μερκαπτοπροπιονικό οξύ σε υδατικό περιβάλλον σε διάφορες συνθήκες. Ακολουθεί χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων με τη λήψη φασμάτων εκπομπής φθορισμού.
(Γ) Παρασκευή νανοπλειάδων χρυσού με την πρωτεΐνη αλβουμίνη, οι οποίες παρουσιάζουν χαρακτηριστικό φθορισμό.
(Δ) Σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου είτε με συγκαταβύθιση αλάτων Fe3+ και Fe2+ ή με οξείδωση Fe2+ σε αλκαλικό περιβάλλον. Στη συνέχεια μελετήθηκε η χημική τροποποίηση της επιφάνειας των νανοσωματιδίων. Έγινε εισαγωγή πρωτοταγών αμινομάδων αντιδρώντας με αμινοπροπυλοτριαιθοξυσιλάνιο και περαιτέρω βιοτινυλίωση των αμινομάδων. Τα νανοσωματίδια χαρακτηρίζονται με ηλεκτρονική μικροσκοπία διαπερατότητας (TEM). Η επιβεβαίωση της παρουσίας της βιοτίνης στην επιφάνεια των σωματιδίων πραγματοποιήθηκε με πρόσδεση του συζεύγματος στρεπταβιδίνη-αλκαλική φωσφατάση και δοκιμασία της ενεργότητας του ενζύμου μετά από προσθήκη του φωσφορικού εστέρα της π-νιτροφαινόλης ως χρωμογόνου υποστρώματος.
|
|---|
