Παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και νανοσωματιδίων
Οι φωταυγάζουσες πρωτεΐνες και τα φθορίζοντα νανοσωματίδια αποτελούν αντικείμενα έντονης ερευνητικής δραστηριότητας τα τελευταία χρόνια γιατί έχουν εισαχθεί ως νέοι ιχνηθέτες στις σύγχρονες μεθόδους χημικής ανάλυσης. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια επίσης χρησιμοποιούνται σε πληθώρα αναλυτικών μεθόδων γι...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2018
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/11195 |
| id |
nemertes-10889-11195 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Βιοφωταύγεια Φωτοπρωτεΐνες Φθορίζοντα νανοσωματίδια Κβαντικές τελείες Νανοπλειάδες χρυσού Μαγνητικά νανοσωματίδια Bioluminescence Photoproteins Fluorescent nanoparticles Quantum dots Gold nanoclusters Magnetic nanoparticles 572.435 |
| spellingShingle |
Βιοφωταύγεια Φωτοπρωτεΐνες Φθορίζοντα νανοσωματίδια Κβαντικές τελείες Νανοπλειάδες χρυσού Μαγνητικά νανοσωματίδια Bioluminescence Photoproteins Fluorescent nanoparticles Quantum dots Gold nanoclusters Magnetic nanoparticles 572.435 Καλλιγοσφύρη, Παναγιώτα Παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και νανοσωματιδίων |
| description |
Οι φωταυγάζουσες πρωτεΐνες και τα φθορίζοντα νανοσωματίδια αποτελούν αντικείμενα έντονης ερευνητικής δραστηριότητας τα τελευταία χρόνια γιατί έχουν εισαχθεί ως νέοι ιχνηθέτες στις σύγχρονες μεθόδους χημικής ανάλυσης. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια επίσης χρησιμοποιούνται σε πληθώρα αναλυτικών μεθόδων για τον ταχύ και απλό διαχωρισμό μορίων από διάλυμα με τη βοήθεια μαγνητικού πεδίου. Αντικείμενο της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας είναι η πειραματική μελέτη διαφόρων μεθόδων παρασκευής φωτοπρωτεϊνών και νανοσωματιδίων.
Συγκεκριμένα η εργασία πραγματεύεται τα εξής:
(A) Υπερέκφραση, απομόνωση και καθαρισμό ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης σε βακτήρια. Αρχικά υπερεκφράζεται η αποπρωτεΐνη αποαικουορίνη σε E. coli χρησιμοποιώντας πλασμιδιακό φορέα, ο οποίος φέρει το πεπτίδιο οδηγό της πρωτεΐνης Α έτσι ώστε η αποαικουορίνη μετά τη σύνθεσή της να οδηγείται στον περιπλασμικό χώρο του κυττάρου. Ακολουθεί απομόνωση της αποαικουορίνης με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου, συμπλοκοποίηση (ενεργοποίηση) με σελεντεραζίνη και καθαρισμός της ενεργής αικουορίνης με χρωματογραφία υδρόφοβων ομάδων. Η ενεργότητα της αικουορίνης προσδιορίζεται με βάση την ένταση της εκπεμπόμενης βιοφωταύγειας μετά από προσθήκη ιόντων Ca2+. Η απόδοση της μεθόδου είναι 4 φορές μεγαλύτερη από προηγούμενη μέθοδο που περιλάμβανε έκφραση της αποαικουορίνης στο κυτταρόπλασμα, διαλυτοποίηση των σχηματιζόμενων συσσωματωμάτων εγκλεισμού και χρωματογραφικό διαχωρισμό.
(B) Παρασκευή φθοριζόντων ημιαγώγιμων νανοκρυστάλλων (κβαντικές τελείες, quantum dots, QDs). Μελετήθηκαν μέθοδοι σύνθεσης QDs είτε σε οργανικούς διαλύτες ή σε υδατικό περιβάλλον με έμφαση την παρασκευή τους σε υδατικά διαλύματα γιατί είναι συμβατά με τις συνθήκες ανάλυσης βιομορίων. Παρουσιάζεται η σύνθεση κβαντικών τελειών CdSe σε οργανικούς διαλύτες και η σύνθεση κβαντικών τελειών CdS σταθεροποιημένων με μερκαπτοπροπιονικό οξύ σε υδατικό περιβάλλον σε διάφορες συνθήκες. Ακολουθεί χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων με τη λήψη φασμάτων εκπομπής φθορισμού.
(Γ) Παρασκευή νανοπλειάδων χρυσού με την πρωτεΐνη αλβουμίνη, οι οποίες παρουσιάζουν χαρακτηριστικό φθορισμό.
(Δ) Σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου είτε με συγκαταβύθιση αλάτων Fe3+ και Fe2+ ή με οξείδωση Fe2+ σε αλκαλικό περιβάλλον. Στη συνέχεια μελετήθηκε η χημική τροποποίηση της επιφάνειας των νανοσωματιδίων. Έγινε εισαγωγή πρωτοταγών αμινομάδων αντιδρώντας με αμινοπροπυλοτριαιθοξυσιλάνιο και περαιτέρω βιοτινυλίωση των αμινομάδων. Τα νανοσωματίδια χαρακτηρίζονται με ηλεκτρονική μικροσκοπία διαπερατότητας (TEM). Η επιβεβαίωση της παρουσίας της βιοτίνης στην επιφάνεια των σωματιδίων πραγματοποιήθηκε με πρόσδεση του συζεύγματος στρεπταβιδίνη-αλκαλική φωσφατάση και δοκιμασία της ενεργότητας του ενζύμου μετά από προσθήκη του φωσφορικού εστέρα της π-νιτροφαινόλης ως χρωμογόνου υποστρώματος. |
| author2 |
Χριστόπουλος, Θεόδωρος |
| author_facet |
Χριστόπουλος, Θεόδωρος Καλλιγοσφύρη, Παναγιώτα |
| format |
Thesis |
| author |
Καλλιγοσφύρη, Παναγιώτα |
| author_sort |
Καλλιγοσφύρη, Παναγιώτα |
| title |
Παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και νανοσωματιδίων |
| title_short |
Παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και νανοσωματιδίων |
| title_full |
Παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και νανοσωματιδίων |
| title_fullStr |
Παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και νανοσωματιδίων |
| title_full_unstemmed |
Παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και νανοσωματιδίων |
| title_sort |
παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και νανοσωματιδίων |
| publishDate |
2018 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/11195 |
| work_keys_str_mv |
AT kalligosphyrēpanagiōta paraskeuēanasyndyasmenōnprōteïnōnkainanosōmatidiōn AT kalligosphyrēpanagiōta synthesisofrecombinantproteinsandnanoparticles |
| _version_ |
1771297269955428352 |
| spelling |
nemertes-10889-111952022-09-05T20:32:13Z Παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και νανοσωματιδίων Synthesis of recombinant proteins and nanoparticles Καλλιγοσφύρη, Παναγιώτα Χριστόπουλος, Θεόδωρος Καλογιάννη, Δέσποινα Πουλόπουλος, Παναγιώτης Kalligosfyri, Panagiota Βιοφωταύγεια Φωτοπρωτεΐνες Φθορίζοντα νανοσωματίδια Κβαντικές τελείες Νανοπλειάδες χρυσού Μαγνητικά νανοσωματίδια Bioluminescence Photoproteins Fluorescent nanoparticles Quantum dots Gold nanoclusters Magnetic nanoparticles 572.435 Οι φωταυγάζουσες πρωτεΐνες και τα φθορίζοντα νανοσωματίδια αποτελούν αντικείμενα έντονης ερευνητικής δραστηριότητας τα τελευταία χρόνια γιατί έχουν εισαχθεί ως νέοι ιχνηθέτες στις σύγχρονες μεθόδους χημικής ανάλυσης. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια επίσης χρησιμοποιούνται σε πληθώρα αναλυτικών μεθόδων για τον ταχύ και απλό διαχωρισμό μορίων από διάλυμα με τη βοήθεια μαγνητικού πεδίου. Αντικείμενο της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας είναι η πειραματική μελέτη διαφόρων μεθόδων παρασκευής φωτοπρωτεϊνών και νανοσωματιδίων. Συγκεκριμένα η εργασία πραγματεύεται τα εξής: (A) Υπερέκφραση, απομόνωση και καθαρισμό ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης σε βακτήρια. Αρχικά υπερεκφράζεται η αποπρωτεΐνη αποαικουορίνη σε E. coli χρησιμοποιώντας πλασμιδιακό φορέα, ο οποίος φέρει το πεπτίδιο οδηγό της πρωτεΐνης Α έτσι ώστε η αποαικουορίνη μετά τη σύνθεσή της να οδηγείται στον περιπλασμικό χώρο του κυττάρου. Ακολουθεί απομόνωση της αποαικουορίνης με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου, συμπλοκοποίηση (ενεργοποίηση) με σελεντεραζίνη και καθαρισμός της ενεργής αικουορίνης με χρωματογραφία υδρόφοβων ομάδων. Η ενεργότητα της αικουορίνης προσδιορίζεται με βάση την ένταση της εκπεμπόμενης βιοφωταύγειας μετά από προσθήκη ιόντων Ca2+. Η απόδοση της μεθόδου είναι 4 φορές μεγαλύτερη από προηγούμενη μέθοδο που περιλάμβανε έκφραση της αποαικουορίνης στο κυτταρόπλασμα, διαλυτοποίηση των σχηματιζόμενων συσσωματωμάτων εγκλεισμού και χρωματογραφικό διαχωρισμό. (B) Παρασκευή φθοριζόντων ημιαγώγιμων νανοκρυστάλλων (κβαντικές τελείες, quantum dots, QDs). Μελετήθηκαν μέθοδοι σύνθεσης QDs είτε σε οργανικούς διαλύτες ή σε υδατικό περιβάλλον με έμφαση την παρασκευή τους σε υδατικά διαλύματα γιατί είναι συμβατά με τις συνθήκες ανάλυσης βιομορίων. Παρουσιάζεται η σύνθεση κβαντικών τελειών CdSe σε οργανικούς διαλύτες και η σύνθεση κβαντικών τελειών CdS σταθεροποιημένων με μερκαπτοπροπιονικό οξύ σε υδατικό περιβάλλον σε διάφορες συνθήκες. Ακολουθεί χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων με τη λήψη φασμάτων εκπομπής φθορισμού. (Γ) Παρασκευή νανοπλειάδων χρυσού με την πρωτεΐνη αλβουμίνη, οι οποίες παρουσιάζουν χαρακτηριστικό φθορισμό. (Δ) Σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου είτε με συγκαταβύθιση αλάτων Fe3+ και Fe2+ ή με οξείδωση Fe2+ σε αλκαλικό περιβάλλον. Στη συνέχεια μελετήθηκε η χημική τροποποίηση της επιφάνειας των νανοσωματιδίων. Έγινε εισαγωγή πρωτοταγών αμινομάδων αντιδρώντας με αμινοπροπυλοτριαιθοξυσιλάνιο και περαιτέρω βιοτινυλίωση των αμινομάδων. Τα νανοσωματίδια χαρακτηρίζονται με ηλεκτρονική μικροσκοπία διαπερατότητας (TEM). Η επιβεβαίωση της παρουσίας της βιοτίνης στην επιφάνεια των σωματιδίων πραγματοποιήθηκε με πρόσδεση του συζεύγματος στρεπταβιδίνη-αλκαλική φωσφατάση και δοκιμασία της ενεργότητας του ενζύμου μετά από προσθήκη του φωσφορικού εστέρα της π-νιτροφαινόλης ως χρωμογόνου υποστρώματος. In recent years, photoproteins and fluorescent nanoparticles have become the focus of intensive research due to their potential as excellent reporters in modern analytical methods. Magnetic nanoparticles have also been introduced in a plethora of analytical methods because they enable the simple and rapid separation of molecules from the liquid phase with the help of a magnetic field. The objective of the present MSc work is to study, experimentally, various methods of preparation of recombinant photoproteins and nanoparticles. More specifically, this thesis includes the following: (A) Overexpression, isolation and purification of recombinant photoprotein aequorin in bacteria. First, the apoprotein apoaequorin is expressed in E. coli by using a plasmid vector that allows expression of apoaequorin fused with ompA peptide. The ompA peptide leads the synthesized protein to the periplasmic space thereby facilitating its purification. Apoaequorin is isolated by immobilized metal ion affinity chromatography and then the fully active aequorin is prepared through complexation of apoaequorin with coelenterazine. Aequorin is further purified by hydrophobic chromatography. The activity of aequorin is measured by the characteristic bioluminescent reaction upon the addition of Ca2+. The yield is about 4 times higher than the method previously reported by our laboratory that involves expression in the cytoplasm, solubilization of inclusion bodies, chromatographic separation and activation of the protein. (B) Preparation of fluorescent semiconductor nanocrystals (quantum dots, QDs). We studied synthetic methods performed either in organic solvents or in aqueous solution. Emphasis was given in the aqueous media because of their compatibility with biomolecular analysis. The synthesis of CdSe quantum dots in organic solvents and the synthesis of CdS quantum dots, stabilized with mercaptopropionic acid, in aqueous solution are presented. The nanoparticles were characterized by fluorescence spectroscopy. (C) Preparation of gold nanoclusters with the protein albumin. These nanoparticles exhibit interesting fluorescence properties. (D) Synthesis of iron oxide magnetic nanoparticles either by coprecipitation of Fe3+ and Fe2+ salts in alkaline solution or by the alkaline oxidation of Fe2+. We also studied the chemical modification of the surface of the synthesized nanoparticles. Primary amino groups were introduced via the reaction with aminopropyltriethoxysilane. The amino groups were then biotinylated. The nanoparticles were characterized by transmission electron microscopy (TEM). The confirmation of the presence of biotin moieties on the surface of the particles was accomplished by reacting with alkaline phosphatase-conjugated streptavidin. The activity of nanoparticle-attached phosphatase was revealed through the addition of the chromogenic substrate p-nitrophenyl phosphate. 2018-04-12T08:39:54Z 2018-04-12T08:39:54Z 2017-03-20 Thesis http://hdl.handle.net/10889/11195 gr 12 application/pdf |
