| Περίληψη: | Η χωροχρονική ρύθμιση της αντιγραφής του γενετικού υλικού εξασφαλίζεται με την αδειοδότησης των αφετηριών της αντιγραφής κατά τη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η πρωτεΐνη Cdt1 καθορίζει πότε θα λάβει χώρα η αδειοδότηση και η έκφρασή της είναι αυστηρώς ρυθμισμένη μέσω πολλαπλών μονοπατιών. Διατάραξη αυτών των μηχανισμών δύναται να οδηγήσει σε γονιδιωματική αστάθεια, ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό ή σε κυτταρικό θάνατο.
Γονιδιωματική αστάθεια σε ένα οργανισμό μπορεί να προκληθεί από βλάβες στο γενετικό υλικό, είτε εξαιτίας περιβαλλοντικών παραγόντων, είτε εξαιτίας τυχαίων αλλαγών από παραπροϊόντα του μεταβολισμού ή λάθη κατά την αντιγραφή. Για την αντιμετώπιση των διαφόρων βλαβών έχουν επιλεγεί εξελικτικά επιδιορθωτικοί μηχανισμοί εξειδικευμένοι στην αντιμετώπιση κάθε τύπου βλάβης. Η πρωτεΐνη Cdt1 φαίνεται να διασυνδέει τα μονοπάτια της αδειοδότησης της αντιγραφής με αυτά της απόκρισης σε βλάβη στο DNA, υπογραμμίζοντας τον κεντρικό ρόλο για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας.
Παρά το γεγονός ότι ο ρόλος του Cdt1 στην περιοχή της βλάβης είναι άγνωστος, το τρέχον μοντέλο ρύθμισης του Cdt1 βάση in vitro πειραμάτων σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα αυγών Xenopus υποστηρίζει ότι το Cdt1 αρχικά προσδένεται στην περιοχή της βλάβης μέσω αλληλεπίδρασης με το PCNA. Ακολούθως, το Cdt2 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης μέσω του Cdt1 και το στοχεύει για πρωτεόλυση. Στο πρώτο μέρος της μελέτης μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις των μερών του συμπλόκου PCNA-Cdt1-Cdt2 οι οποίες λαμβάνουν χώρα ύστερα από βλάβη από υπεριώδη ακτινοβολία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με τη χρήση λειτουργικής μικροσκοπίας. Κατόπιν εφαρμογής εντοπισμένης υπεριώδους ακτινοβολίας, το PCNA στρατολογείται ταχέα και δεσμεύεται ισχυρά με τη χρωματίνη στη περιοχή της βλάβης. Σε αντίθεση με το τρέχον μοντέλο, αποδεικνύεται ότι το Cdt2 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης ανεξάρτητα από το Cdt1 και διατηρεί μακροχρόνιες αλληλεπιδράσεις με τη χρωματίνη. Η δέσμευση του Cdt2 στην περιοχή της βλάβης γίνεται με άμεση αλληλεπίδρασης με το PCNA μέσω μοτίβου αλληλεπίδρασης με το PCNA (PiP-box) που φέρει στην καρβοξυτελική περιοχή του. Το Cdt1 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης μέσω PiP-box στο αμινοτελικό άκρο και σταθεροποιείται στην περιοχή της βλάβης διαμέσου άμεσης αλληλεπίδρασης με το Cdt2. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση φωσφορυλίωσης από την ΑΤΜ/ATR κινάση. Δείξαμε ότι η φωσφορυλίωση του Cdt2 από την ΑΤΜ/ATR, αναστέλλει τη σταθεροποίηση του Cdt1 στη περιοχή της βλάβης.
Στο δεύτερο μέρος της μελέτης ερευνάται ο ρόλος του Cdt1 στην περιοχή της βλάβης και η πιθανή εμπλοκή του στην επιλογή κατάλληλου επιδιορθωτικού μηχανισμού. Τα πειράματα που περιγράφονται μελετούν διπλές θραύσεις οι οποίες έγιναν είτε με χρήση ακτίνων X είτε με την χρήση παλμικού UVA laser 355nm σε ανθρώπινες καρκινικές σειρές. Στην παρούσα μελέτη ότι η απουσία του Cdt1 δείξαμε να αυξάνει τον ρυθμό συγκέντρωσης των TLS πολυμερασών polκ και polη στην περιοχή της βλάβης παίζοντας ρόλο στη χρονική ρύθμιση της επιδιόρθωσης. Επίσης, πειράματα που έγιναν με ημιαυτόματους αλγόριθμους επεξεργασίας και ανάλυσης εικόνας, βρέθηκε ότι η απουσία του Cdt1 επηρεάζει αρνητικά την συγκέντρωση παραγόντων επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων μέσω μη ομόλογης συνένωσης των άκρων (NHEJ) και συγκεκριμένα των 53BP1 και Rif1 σε ανθρώπινες καρκινικές σειρές μαστού (MCF7) και τραχήλου (HeLa kyoto). Αντίθετα, δεν φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά η συσσώρευση παραγόντων που εμπλέκονται στην έναρξη του ομόλογου ανασυνδυασμού όπως το BRCA1. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ένα σημαντικό ρόλο του παράγοντα Cdt1 στην επιλογη μονοπατιού επιδιόρθωσης βλάβης στο DNA.
Στο τρίτο μέρος της μελέτης παρουσιάζονται αναλυτικές μέθοδοι ποσοτικοποίησης και ποιοτικής ανάλυσης που αναπτύχθηκαν για την μελέτη τόσο της πρωτεϊνικής κινητικής στρατολόγησης σε ζωντανά κύτταρα (recruitment-timelapse) αλλά και για την ημι-αυτοματοποιημένη μέτρηση εστιών σε υποπυρηνικές περιοχές και τη ποσοτικοποίηση πυρηνικών πρωτεΐνών σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τέλος θα περιγραφούν αλγόριθμοι προεπεξεργασίας εικόνας για μετρήσεις αποστάσεων και όγκων.
|
|---|
