Ο ρόλος της Geminin στη μεταμόσχευση ενήλικων βλαστικών κυττάρων σε μοντέλο μυός της νόσου Πάρκινσον

• Κύριος συγγραφέας: Ταούκη, Ιωάννα
• Άλλοι συγγραφείς: Ταραβήρας, Σταύρος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2018
• Θέματα: Ενήλικα νευρικά βλαστικά κύτταρα; Μοντέλο της 6-OHDA; Νόσος του Πάρκινσον; Μεταμόσχευση; Adult neural stem cells; Transplantation; Parkinson's disease; Geminin; 6-OHDA model; 616.833 069 5

Η ιδιοπαθής νόσος του Parkinson αποτελεί μία νευροεκφυλιστική διαταραχή, η οποία χαρακτηρίζεται από την προοδευτική απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων στη μελανοραβδωτή οδό. Οι έως τώρα χρησιμοποιούμενες θεραπευτικές στρατηγικές για την αντιμετώπισή της βασίζονται κυρίως στη φαρμακευτική αγωγή και στην εν τω βάθει διέγερση του εγκεφάλου. Παρόλ’αυτά, οι στρατηγικές αυτές είναι αποτελεσματικές μόνο στα πρώιμα στάδια της ασθένειας, ενώ δεν δύνανται να αναστείλουν την πορεία εξέλιξης της νόσου. Για το λόγο αυτό, οι πρόσφατες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην βελτιστοποίηση των τεχνικών της κυτταρικής θεραπείας ως μέθοδο αντιμετώπισης της ασθένειας του Parkinson. Συγκεκριμένα, τα νευρικά βλαστικά κύτταρα, που προέρχονται είτε από εμβρυϊκό είτε από ενήλικο ιστό, αποτελούν ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο σε μελέτες μεταμοσχεύσεων που πραγματοποιούνται σε πειραματικά μοντέλα της νόσου του Parkinson σε προκλινικό επίπεδο. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η ικανότητα ενσωμάτωσης και διαφοροποίησης γενετικώς τροποποιημένων ενήλικων νευρικών βλαστικών κυττάρων έπειτα από μεταμόσχευσή τους στον εγκέφαλο παρκινσονικού μοντέλου μυός, καθώς και ο ρόλος της πρωτεΐνης Geminin κατά τη διαδικασία αυτή. Συγκεκριμένα, για τη διερεύνηση των παραπάνω ερωτημάτων χρησιμοποιήθηκε το τοξικό πειραματικό μοντέλο της 6-OHDA. Το μοντέλο αυτό, που προσομοιάζει τα νευροφυσιολογικά χαρακτηριστικά της ασθένειας του Parkinson, δημιουργήθηκε μέσω της στερεοτακτικής έγχυσης της νευροτοξίνης 6-ΟΗDA στη μελανοραβδωτή οδό του δεξιού εγκεφαλικού ημισφαιρίου μυών C57 BL6 (AP: -2.1, ML: -1.1, DV: -4,6 και -4.8). Το αριστερό ημισφαίριο των μυών παρέμεινε ανέπαφο και χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας, επιτρέποντάς τη διεξαγωγή συμπερασμάτων κατά τη σύγκρισή του με το ημισφαίριο που είχε υποστεί βλάβη. Η αποτελεσματικότητα της βλάβης ελέγχθηκε με χρήση του συμπεριφορικού τεστ της απομορφίνης. Μετά το πέρας 3-4 εβδομάδων, πραγματοποιήθηκε στερεοτακτική έγχυση μοσχεύματος ενήλικων βλαστικών κυττάρων συγκέντρωσης 100.000/2μl σε διάλυμα PBS 1x στο ραβδωτό σώμα των μυών που είχαν υποστεί επαρκή νευροεκφύλιση των ντοπαμινεργικών τους νευρώνων (AP: +1.0, ML: -1.9, DV: -2.7 και -3). Διακρίθηκαν δύο ομάδες πειραματοζώων ανάλογα με το μόσχευμα που δέχτηκαν, η πειραματική ομάδα, στην οποία μεταμοσχεύτηκαν γενετικά τροποποιημένα κύτταρα τα οποία δεν εξέφραζαν την πρωτεΐνη Geminin, και η ομάδα ελέγχου στην οποία μεταμοσχεύτηκαν κύτταρα αγρίου τύπου. Για την ανίχνευση των κυττάρων, τα γενετικώς τροποποιημένα νευρικά βλαστικά κύτταρα εξέφραζαν την πρωτεΐνη GFP. Ακολούθησε ποιοτική εκτίμηση της επιτυχίας των μεταμοσχεύσεων με το τεστ της απομορφίνης, κατά την οποία παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική μείωση των περιστροφών στα πειραματόζωα συγκριτικά με το συμπεριφορικό τεστ έπειτα απο την πραγματοποίηση των στερεοτακτικών βλαβών. Στη συνέχεια, έπειτα από απομόνωση του εγκεφαλικού ιστού, πραγματοποίηση πειραμάτων ανοσοφθορισμού και ανάλυσή τους με συνεστιακή μικροσκοπία, διαπιστώθηκε η διαφοροποίηση των μοσχευμάτων στο ραβδωτό σώμα τόσο των πειραματοζώων της πειραματικής ομάδας, όσο και της ομάδας ελέγχου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αποσιώπηση της Geminin δεν επηρεάζει το σχηματισμό των μοσχευμάτων μέσα στο νευροεκφυλισμένο ραβδωτό. Τα μοσχεύματα και των δύο ομάδων παρουσίασαν τον σχηματισμό επίμηκων δομών μεγέθους 304-552μm ως προς τον ραχιαίο-κοιλιακό άξονα και εκτείνονταν στον προσθοπίσθιο άξονα σε απόσταση 342-468μm. Το ποσοστό της κυτταρικής επιβίωσης βρέθηκε ελαφρώς μικρότερο στην πειραματική ομάδα (0.22%) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (0.30%) χωρίς όμως να παρουσιάζεται στατιστικώς σημαντική διαφορά. Η απουσία της Geminin παρατηρήθηκε να προκαλεί μείωση στο ποσοστό διαφοροποίησης των μεταμοσχευθέντων κυττάρων σε ώριμους νευρώνες, και συγκεκριμένα σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες, που ενσωματώθηκαν στο κατεστραμμένο ραβδωτό σώμα. Και στις δύο ομάδες βρέθηκε ότι ένα μεγάλο ποσοστό των κυττάρων του μοσχεύματος βρίσκεται σε αδιαφοροποίητη κατάσταση και διατηρεί την ικανότητα πολλαπλασιασμού, γεγονός που δεν φάνηκε να επηρεάζεται από την απουσία της Geminin. Τέλος, αρχικά δεδομένα παρουσιάζουν την πιθανή αύξηση των ολιγοδενδροκυττάρων απουσία της Geminin, γεγονός που υποδηλώνει ότι κατά την έλλειψή της τα μεταμοσχευθέντα κύτταρα πιθανώς επιλέγουν την πορεία γλοιογένεσης έναντι της νευρογένεσης.