Μελέτη του δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων
Τα πολυκροσσωτά κύτταρα (MCCs) είναι τελικώς διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα που φέρουν στην κορυφαία μεμβράνη τους εκατοντάδες κροσσούς. Η συγχρονισμένη κίνηση των οργανιδίων αυτών προάγει την κίνηση ρευστών στην επιθηλιακή επιφάνεια όπως του εγκεφαλονωτιαίου υγρού και της βλέννας στο κεντρικ...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2018
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/11419 |
| id |
nemertes-10889-11419 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Διαφοροποίηση Πολυκροσσωτά κύτταρα Μεταγραφικοί παράγοντες Differentiation Multiciliated Cells Transcription factors 572.884 5 |
| spellingShingle |
Διαφοροποίηση Πολυκροσσωτά κύτταρα Μεταγραφικοί παράγοντες Differentiation Multiciliated Cells Transcription factors 572.884 5 Λουκάς, Ιωάννης Μελέτη του δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων |
| description |
Τα πολυκροσσωτά κύτταρα (MCCs) είναι τελικώς διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα που
φέρουν στην κορυφαία μεμβράνη τους εκατοντάδες κροσσούς. Η συγχρονισμένη κίνηση των
οργανιδίων αυτών προάγει την κίνηση ρευστών στην επιθηλιακή επιφάνεια όπως του
εγκεφαλονωτιαίου υγρού και της βλέννας στο κεντρικό νευρικό και στο αναπνευστικό σύστημα
αντίστοιχα. Πρόσφατα δύο μέλη της υπεροικογένειας Geminin χαρακτηρίστηκαν ως κύριου
ρυθμιστές της πολυκροσσογένεσης δρώντας κατά τα πρώιμα στάδια αυτής. Καθοδικά στο μονοπάτι,
άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες όπως οι Foxj1, Myb, p73 και τα μέλη της οικογένειας RFX ρυθμίζουν
την μεταγραφή πολλαπλών γονιδίων για να πραγματοποιηθούν τα ύστερα στάδια της
μετανάστευσης των κεντριολίων και της κροσσογένεσης. Παρόλα αυτά η δομή του δικτύου των
μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζει την διαφοροποίηση προς τα πολυκροσσωτά κύτταρα
καθώς και οι αλληλεπιδράσεις εντός αυτού παραμένουν άγνωστες.
Με σκοπό την καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που προάγουν την
διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων, πραγματοποιήθηκαν ex vivo πειράματα για την
ταυτοποίηση πιθανών αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών της οικογένειας Geminin με άλλους
μεταγραφικούς παράγοντες καθώς και για τον προσδιορισμό των πιθανών μεταγραφικών τους
στόχων. Μέσω πειραμάτων συν-ανοσοκατακρήμνισης δείχθηκε πως ο GemC1 αλληλεπιδρά με τους
μεταγραφικούς παράγοντες E2F5 και DP1 δημιουργώντας το σύμπλοκο EDG. Για την αλληλεπίδραση
αυτή, είναι απαραίτητο το συντηρημένο καρβόξυτελικό άκρο του GemC1, σε αναλογία με το τι έχει
δειχτεί για την αλληλεπίδραση του McIdas με τον E2F5. Οι ex vivo δοκιμασίες λουσιφεράσης
υπέδειξαν πως τόσο το καρβοξυτελικό άκρο όσο και το σπειροειδές σπείραμα των GemC1 και McIdas
είναι απαραίτητα για την μεταγραφική ενεργότητα των πρωτεϊνών αυτών. Εκτοπική υπερέκφραση
των μελών του συμπλόκου EDG σε διάφορες κυτταρικές σειρές οδηγεί σε σημαντική επαγωγή
μεταγραφικών παραγόντων και πρωτεϊνών που είναι απαραίτητα είτε για την δημιουργία των
πολλαπλών κεντριολίων (McIdas, Myb, Ccno, Cdc20b) είτε μετέπειτα για την κορυφαία
μετανάστευση αυτών (p73, Foxj1). Αντίθετα, όταν η Geminin είναι παρούσα, προσδένεται στο
σπειροειδές σπείραμα του GemC1 και καταστέλλει την μεταγραφική ενεργότητα των συμπλόκων
EDG.
Επιπρόσθετα δείχθηκε πως όλα τα μέλη της υπεροικογένειας Geminin αλληλεπιδρούν με τον
μεταγραφικό παράγοντα p73. Η δημιουργία του συμπλόκου GemC1-p73 απαιτεί πολλαπλές θέσεις
αλληλεπίδρασης τόσο στο σπειροειδές σπείραμα όσο και στο καρβοξυτελικό άκρο του GemC1.
Μετέπειτα πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν πως ο GemC1 είναι ικανός να στρατολογεί
τον p73 σε E2F5 σύμπλοκα. Εκτοπική υπερέκφραση όλων των παραπάνω πρωτεϊνών σε διάφορους
συνδυασμούς δεν έδειξε λειτουργική συνέργεια μεταξύ του p73 και του συμπλόκου GemC1/E2F5
κατά την μεταγραφική ρύθμιση σημαντικών γονιδίων. Περεταίρω ανάλυση απαιτείται έτσι ώστε να
προσδιορισθεί η φύση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μελών της υπεροικογένειας Geminin και
του p73, καθώς και πως αυτές καθορίζουν την ρύθμιση γονιδίων κατά την πολυκροσσογένεση. Τέλος,
δείχθηκε πως ο GemC1 αλληλεπιδρά με τον μεταγραφικό παράγοντα p63, που δρα ως σημαντικός
ρυθμιστής των αποφάσεων των αδιαφοροποίητων βασικών κυττάρων. Περεταίρω μελέτες
απαιτούνται για να διευκρινιστεί η φύση αυτής της αλληλεπίδρασης και η πιθανή συμβολή του
GemC1 στον καθορισμό της κυτταρικής μοίρας των προγονικών κυττάρων.Συνοπτικά, τα παραπάνω δεδομένα εξηγούν μηχανιστικά τον παθολογικό φαινότυπο που
παρατηρείται κατά την διαφοροποίηση προς πολυκροσσωτά κύτταρα όταν οι πρωτεΐνες GemC1 και
McIdas απουσιάζουν. Επιπλέον υποδεικνύουν και πιθανή συμβολή των μορίων αυτών στις
αποφάσεις των προγονικών βλαστικών κυττάρων. |
| author2 |
Λυγερού, Ζωή |
| author_facet |
Λυγερού, Ζωή Λουκάς, Ιωάννης |
| format |
Thesis |
| author |
Λουκάς, Ιωάννης |
| author_sort |
Λουκάς, Ιωάννης |
| title |
Μελέτη του δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων |
| title_short |
Μελέτη του δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων |
| title_full |
Μελέτη του δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων |
| title_fullStr |
Μελέτη του δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων |
| title_full_unstemmed |
Μελέτη του δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων |
| title_sort |
μελέτη του δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων |
| publishDate |
2018 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/11419 |
| work_keys_str_mv |
AT loukasiōannēs meletētoudiktyoutōnmetagraphikōnparagontōnpouepagountēdiaphoropoiēsētōnpolykrossōtōnkyttarōn AT loukasiōannēs studyofthetranscriptionfactornetworkpromotingmulticiliatedcelldifferentiation |
| _version_ |
1771297200236658689 |
| spelling |
nemertes-10889-114192022-09-05T11:16:55Z Μελέτη του δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που επάγουν τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων Study of the transcription factor network promoting multiciliated cell differentiation Λουκάς, Ιωάννης Λυγερού, Ζωή Ταραβήρας, Σταύρος Καζάνης, Ηλίας Loukas, Ioannis Διαφοροποίηση Πολυκροσσωτά κύτταρα Μεταγραφικοί παράγοντες Differentiation Multiciliated Cells Transcription factors 572.884 5 Τα πολυκροσσωτά κύτταρα (MCCs) είναι τελικώς διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα που φέρουν στην κορυφαία μεμβράνη τους εκατοντάδες κροσσούς. Η συγχρονισμένη κίνηση των οργανιδίων αυτών προάγει την κίνηση ρευστών στην επιθηλιακή επιφάνεια όπως του εγκεφαλονωτιαίου υγρού και της βλέννας στο κεντρικό νευρικό και στο αναπνευστικό σύστημα αντίστοιχα. Πρόσφατα δύο μέλη της υπεροικογένειας Geminin χαρακτηρίστηκαν ως κύριου ρυθμιστές της πολυκροσσογένεσης δρώντας κατά τα πρώιμα στάδια αυτής. Καθοδικά στο μονοπάτι, άλλοι μεταγραφικοί παράγοντες όπως οι Foxj1, Myb, p73 και τα μέλη της οικογένειας RFX ρυθμίζουν την μεταγραφή πολλαπλών γονιδίων για να πραγματοποιηθούν τα ύστερα στάδια της μετανάστευσης των κεντριολίων και της κροσσογένεσης. Παρόλα αυτά η δομή του δικτύου των μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζει την διαφοροποίηση προς τα πολυκροσσωτά κύτταρα καθώς και οι αλληλεπιδράσεις εντός αυτού παραμένουν άγνωστες. Με σκοπό την καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που προάγουν την διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων, πραγματοποιήθηκαν ex vivo πειράματα για την ταυτοποίηση πιθανών αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών της οικογένειας Geminin με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες καθώς και για τον προσδιορισμό των πιθανών μεταγραφικών τους στόχων. Μέσω πειραμάτων συν-ανοσοκατακρήμνισης δείχθηκε πως ο GemC1 αλληλεπιδρά με τους μεταγραφικούς παράγοντες E2F5 και DP1 δημιουργώντας το σύμπλοκο EDG. Για την αλληλεπίδραση αυτή, είναι απαραίτητο το συντηρημένο καρβόξυτελικό άκρο του GemC1, σε αναλογία με το τι έχει δειχτεί για την αλληλεπίδραση του McIdas με τον E2F5. Οι ex vivo δοκιμασίες λουσιφεράσης υπέδειξαν πως τόσο το καρβοξυτελικό άκρο όσο και το σπειροειδές σπείραμα των GemC1 και McIdas είναι απαραίτητα για την μεταγραφική ενεργότητα των πρωτεϊνών αυτών. Εκτοπική υπερέκφραση των μελών του συμπλόκου EDG σε διάφορες κυτταρικές σειρές οδηγεί σε σημαντική επαγωγή μεταγραφικών παραγόντων και πρωτεϊνών που είναι απαραίτητα είτε για την δημιουργία των πολλαπλών κεντριολίων (McIdas, Myb, Ccno, Cdc20b) είτε μετέπειτα για την κορυφαία μετανάστευση αυτών (p73, Foxj1). Αντίθετα, όταν η Geminin είναι παρούσα, προσδένεται στο σπειροειδές σπείραμα του GemC1 και καταστέλλει την μεταγραφική ενεργότητα των συμπλόκων EDG. Επιπρόσθετα δείχθηκε πως όλα τα μέλη της υπεροικογένειας Geminin αλληλεπιδρούν με τον μεταγραφικό παράγοντα p73. Η δημιουργία του συμπλόκου GemC1-p73 απαιτεί πολλαπλές θέσεις αλληλεπίδρασης τόσο στο σπειροειδές σπείραμα όσο και στο καρβοξυτελικό άκρο του GemC1. Μετέπειτα πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν πως ο GemC1 είναι ικανός να στρατολογεί τον p73 σε E2F5 σύμπλοκα. Εκτοπική υπερέκφραση όλων των παραπάνω πρωτεϊνών σε διάφορους συνδυασμούς δεν έδειξε λειτουργική συνέργεια μεταξύ του p73 και του συμπλόκου GemC1/E2F5 κατά την μεταγραφική ρύθμιση σημαντικών γονιδίων. Περεταίρω ανάλυση απαιτείται έτσι ώστε να προσδιορισθεί η φύση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μελών της υπεροικογένειας Geminin και του p73, καθώς και πως αυτές καθορίζουν την ρύθμιση γονιδίων κατά την πολυκροσσογένεση. Τέλος, δείχθηκε πως ο GemC1 αλληλεπιδρά με τον μεταγραφικό παράγοντα p63, που δρα ως σημαντικός ρυθμιστής των αποφάσεων των αδιαφοροποίητων βασικών κυττάρων. Περεταίρω μελέτες απαιτούνται για να διευκρινιστεί η φύση αυτής της αλληλεπίδρασης και η πιθανή συμβολή του GemC1 στον καθορισμό της κυτταρικής μοίρας των προγονικών κυττάρων.Συνοπτικά, τα παραπάνω δεδομένα εξηγούν μηχανιστικά τον παθολογικό φαινότυπο που παρατηρείται κατά την διαφοροποίηση προς πολυκροσσωτά κύτταρα όταν οι πρωτεΐνες GemC1 και McIdas απουσιάζουν. Επιπλέον υποδεικνύουν και πιθανή συμβολή των μορίων αυτών στις αποφάσεις των προγονικών βλαστικών κυττάρων. Multiciliated cells (MCCs) are a class of post mitotic epithelial cells that possess in their apical membrane hundreds of microtubule based organelles, called cilia. The synchronized beating of these projections mediates tissue dependent functions in vertebrates like cerebrospinal fluid propulsion in the central nervous system and mucus clearance in the airways. Recently two members of Geminin superfamily, GemC1 and McIdas, were characterized as early regulators of multiciliogenesis. GemC1 and McIdas act upstream of other transcription factors, like Foxj1, Myb, p73 and RFX family members which mediate the later stages of apical docking and cilia formation. The transcriptional network controlling MCC generation however, remains poorly characterized. Aiming to gain insight into the molecular basis underlying multiciliogenesis we applied ex vivo assays to identify potential interactions of Geminin superfamily members with other transcription factors and evaluate their transactivation ability towards known ciliogenesis genes. We show that GemC1 interacts with E2F5 and DP1 forming the EDG complex. This interaction is mediated through the conserved C-terminal region of GemC1, as previously reported for McIdas. Through luciferase reporter assays we demonstrate that both the C-terminal and coiled coil regions of GemC1 and McIdas are essential for their transactivation ability. Ectopic expression of EDG components in various cell lines leads to significant transactivation of downstream transcription factors and genes that mediate multiple centriole generation (McIdas, Myb, Ccno, Cdc20b), apical docking and ciliogenesis (p73, FoxJ1). On the contrary, Geminin binds to the GemC1 coiled coil region abolishing its transcriptional activity. Furthermore, we show that Geminin family members interact with the p73 transcription factor. Mutational analysis, revealed multiple binding interfaces between GemC1 and p73. Through Co-IP experiments we demonstrated that GemC1 can recruit p73 to E2F5 complexes. Ectopic expression of various combinations of these proteins in cell lines failed to detect a notable synergy between p73 and GemC1/E2F5 transactivation activity. Further analysis is necessary to determine the mode of interactions among Geminin superfamily members and p73 along with their functional relevance regarding the cohort genes regulated. Finally, we show that GemC1 interacts with the p63 transcription factor, a major regulator of basal cells, raising the possibility that GemC1 contributes to progenitor cell fate choice. Collectively, the aforementioned data give a mechanistic explanation of the phenotype observed during multiciliogenesis in the absence of GemC1 and McIdas. Moreover, they provide further insight into their potential contribution to cell fate choice and commitment. 2018-07-11T05:04:59Z 2018-07-11T05:04:59Z 2017-06-29 Thesis http://hdl.handle.net/10889/11419 gr 12 application/pdf |
