Η μελέτη της επίδρασης της Geminin στον κυτταρικό κύκλο των νευρικών βλαστικών κυττάρων μυών

• Κύριος συγγραφέας: Καλλιακούδας, Θεόδωρος
• Άλλοι συγγραφείς: Ταραβήρας, Σταύρος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2018
• Θέματα: Κυτταρικός κύκλος; Νευρικά βλαστικά κύτταρα; Geminin; Cell cycle; Neural stem cells; GemC1; McIdas; 571.84

Τα πρόδρομα βλαστικά κύτταρα έχουν την ικανότητα τόσο της αυτο-ανανέωσης όσο και της διαφοροποίησης, κατά την εμβρυογένεση και την ενήλικη ζωή. Η αλληλεξάρτηση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης ελέγχεται από πρωτεΐνες, οι οποίες συντονίζουν τις δύο διαδικασίες. Οι πρωτεΐνες Geminin, GemC1/Lynkeas και McIdas αποτελούν μέλη της ίδιας υπεροικογένειας, εμφανίζοντας ομολογία στην επικράτεια του σπειροειδούς σπειράματος. Έχουν προταθεί ως μόρια ρυθμιστές για τον καθορισμό της μοίρας των πρόδρομων βλαστικών κυττάρων, ρυθμίζοντας την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης, μέσω της αλληλεπίδρασής τους με μεταγραφικούς παράγοντες και σύμπλοκα αναδιάταξης της χρωματίνης. Ωστόσο, ο μηχανισμός, ο οποίος συντονίζει τα δύο μονοπάτια, δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε ο in vitro ρόλος των μελών της υπεροικογένειας Geminin στο προφίλ του κυτταρικού κύκλου, στη βιογένεση του πρωτογενούς κροσσού και στο μεταγραφικό μονοπάτι της πολυκροσσογένεσης. Η πρωτεΐνη Geminin χαρακτηρίζεται ως αρνητικός ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου στα μετάζωα, αλληλεπιδρώντας με τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1 και αναστέλλοντας την επαναντιγραφή του γενετικού υλικού. Επιπρόσθετα, έχει σημαντικό ρόλο στις αποφάσεις αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης των νευρικών βλαστικών κυττάρων της κοιλιακής ζώνης του αναπτυσσόμενου φλοιού και των ενήλικων νευρικών βλαστικών κυττάρων της υποεπενδυματικής ζώνης των πλάγιων κοιλιών. Με σκοπό να διερευνηθεί ο ρόλος της πρωτεΐνης Geminin στο προφίλ του κυτταρικού κύκλου, in vitro, απομονώθηκαν νευρικά βλαστικά κύτταρα (Neural Stem Cells, NSCs) από τον εγκεφαλικό φλοιό εμβρύων μυών, όπου έχει αποσιωποιηθεί ιστοειδικά το γονίδιο Geminin στα αρχικά στάδια της νευρογένεσης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα νευρικά βλαστικά κύτταρα, απουσία της Geminin, φαίνεται να επανεισέρχονται στον κυτταρικό κύκλο με μεγαλύτερο ρυθμό, σε διαφορετικά χρονικά σημεία, μετά την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο, σε G0 φάση. Οι πρωτεΐνες GemC1 και McIdas, τα δύο νέα μέλη της υπεροικογένειας Geminin, έχει βρεθεί ότι συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου στα σπονδυλωτά. Συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη GemC1 συμμετέχει στο σχηματισμό του προεναρκτήριου συμπλόκου στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής, ενώ η πρωτεΐνη McIdas ανταγωνίζεται την πρόσδεση του παράγοντα Cdt1 με την πρωτεΐνη Geminin. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεΐνες GemC1 και McIdas δρουν στα αρχικά στάδια του μονοπατιού της διαφοροποίησης των πολυκροσσωτών κυττάρων στην υποεπενδυματική ζώνη των πλάγιων κοιλιών και στο αναπνευστικό επιθήλιο των μυών, στο δέρμα των εμβρύων Xenopus, στον πρόνεφρο του zebrafish, καθώς και σε ex vivo καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων του αναπνευστικού επιθηλίου, ρυθμίζοντας καθοδικά την έκφραση μεταγραφικών παραγόντων, όπως οι Myb, Ccno, p73 και Foxj1 παράγοντες, οι οποίοι εμπλέκονται στα επιμέρους στάδια της βιογένεσης των πολλαπλών κροσσών. Ανοδικά των παραγόντων GemC1 και McIdas εντοπίζεται η δράση του κανονικού Notch μονοπατιού, αναστέλλοντας την έκφρασή τους. Παλαιότερες μελέτες, in vitro, σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, υποστηρίζουν ότι τα μέλη της υπεροικογένειας p53 ρυθμίζουν διαφορικά την έκφραση των γονιδίων JAG1 και JAG2. Με βάση in vitro μελέτες του εργαστηρίου μας, οι οποίες υποστηρίζουν ότι οι παράγοντες GemC1, E2F5 και p73 αλληλεπιδρούν, σχηματίζοντας σύμπλοκα, διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος των συμπλόκων GemC1/E2F5, GemC1/p73 και GemC1/E2F5/p73 στη μεταγραφική ενεργότητα των γονιδίων JAG1 και JAG2. Τα αποτελέσματά μας από την εκτοπική υπερέκφραση των πρωτεϊνών GemC1, E2F5 και p73, σε όλους τους πιθανούς συνδυασμούς, προτείνουν λειτουργική συνέργεια των GemC1/E2F5 και των GemC1/p73, οδηγώντας σε διαφορική επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων JAG1 και JAG2, αντίστοιχα, ενώ δεν υπήρξε λειτουργική συνέργεια μεταξύ του p73 και του συμπλόκου GemC1/E2F5. Τέλος, μελετήθηκε ο πιθανός ρόλος των πρωτεϊνών GemC1 και McIdas στη βιογένεση του πρωτογενούς κροσσού, ο οποίος αποτελεί κέντρο για τη σηματοδότηση των κυττάρων. Καθώς το κύτταρο βρίσκεται στη G1 φάση ή εξέρχεται από τον κυτταρικό κύκλο, σε φάση G0, το κεντροσωμάτιο μεταναστεύει στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, όπου ακολουθεί η αγκυροβόληση του μητρικού κεντριολίου και ο σχηματισμός του αξονήματος του πρωτογενούς κροσσού. Ένα σύνολο πρωτεϊνών έχει βρεθεί να πλαισιώνει τη βιογένεση του πρωτογενούς κροσσού, όμως, το μοριακό μεταγραφικό δίκτυο, το οποίο ρυθμίζει και συντονίζει τα επιμέρους στάδια του μονοπατιού, είναι ελάχιστα κατανοητό. Με σκοπό να διερευνηθεί ο ρόλος των πρωτεϊνών GemC1 και McIdas στη βιογένεση του πρωτογενούς κροσσού, χρησιμοποιήθηκε in vitro σύστημα καλλιέργειας ινοβλαστών από έμβρυα μυών, οι οποίοι καλλιεργούνται σε συνθήκες στέρησης ορού από το θρεπτικό τους μέσο, ώστε να εξέλθουν από τον κυτταρικό κύκλο και να εμφανίσουν πρωτογενή κροσσό. Η αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου GemC1 δεν ανέδειξε κάποιον πιθανό ρόλο στο σχηματισμό του πρωτογενούς κροσσού, ενώ αντίθετα, η αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου McIdas οδήγησε σε μειωμένο ποσοστό των κυττάρων που εμφάνισαν τον πρωτογενή κροσσό στην επιφάνειά τους. Συμπερασματικά, περεταίρω μελέτη απαιτείται, ώστε να προσδιοριστεί ο ακριβής μηχανιστικός ρόλος των μελών της υπεροικογένειας Geminin στις διαδικασίες ρύθμισης του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των πρόδρομων βλαστικών κυττάρων.