Ανάπτυξη και συνδυασμός μεθόδων περίθλασης ακτίνων-Χ και ηλεκτρονίων για το δομικό χαρακτηρισμό νανοκρυσταλλικών υλικών
Η συγκεκριμένη Διδακτορική Διατριβή αφορά στην ανάπτυξη και εφαρμογή καινοτόμων μεθοδολογιών για τον δομικό χαρακτηρισμό υλικών εστιάζοντας σε πρωτεΐνες φαρμακευτικού ενδιαφέροντος. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μελέτη του πολυμορφισμού της ινσουλίνης και επίλυση της δομής πολυμόρφων της μέσω κρυστ...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2018
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/11514 |
| id |
nemertes-10889-11514 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Κρυσταλλογραφία Δομική βιολογία Ακτινοβολία σύγχροτρον Ινσουλίνη Διαβήτης Οξειδωτικό στρες Crystallography Structural biology Synchrotron radiation Insulin Diabetes Oxidative stress 572.565 |
| spellingShingle |
Κρυσταλλογραφία Δομική βιολογία Ακτινοβολία σύγχροτρον Ινσουλίνη Διαβήτης Οξειδωτικό στρες Crystallography Structural biology Synchrotron radiation Insulin Diabetes Oxidative stress 572.565 Καραβασίλη, Φωτεινή Ανάπτυξη και συνδυασμός μεθόδων περίθλασης ακτίνων-Χ και ηλεκτρονίων για το δομικό χαρακτηρισμό νανοκρυσταλλικών υλικών |
| description |
Η συγκεκριμένη Διδακτορική Διατριβή αφορά στην ανάπτυξη και εφαρμογή καινοτόμων μεθοδολογιών για τον δομικό χαρακτηρισμό υλικών εστιάζοντας σε πρωτεΐνες φαρμακευτικού ενδιαφέροντος. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μελέτη του πολυμορφισμού της ινσουλίνης και επίλυση της δομής πολυμόρφων της μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πολυάριθμα πειράματα κρυστάλλωσης της ινσουλίνης υπό διαφορετικές συνθήκες (pH, οργανικοί προσδέτες). Επιπλέον πραγματοποιήθηκε μελέτη της επίδρασης του οξειδωτικού στρες στη δομή της ανθρώπινης ινσουλίνης, για τη μελέτη της οποίας καταστευάσθηκε εκ νέου σύστημα ελεγχόμενης παραγωγής ελεύθερων ριζών. Η τελευταία μελέτη πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με την ομάδα Βιοχημείας του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου & Ανάπτυξης, του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Οι κρύσταλλοι ινσουλίνης που προέκυψαν είτε μεταβάλλοντας τις συνθήκες κρυστάλλωσης είτε λόγω του οξειδωτικού στρες, μελετήθηκαν μέσω της περίθλασης ακτίνων-Χ αρχικά με τη χρήση εργαστηριακού περιθλασίμετρου και στη συνέχεια στο Ευρωπαϊκό σύγχροτρον, ESRF, της Γαλλίας. Η βασική τεχνική που ακολουθήθηκε για τα πειράματα κρυσταλλογραφίας ήταν η περίθλαση ακτίνων-Χ από πολυκρυσταλλικά δείγματα (X-Ray Powder Diffraction-XRPD), η οποία τα τελευταία χρόνια έχει αναδειχθεί σε ένα σημαντικό εργαλείο χαρακτηρισμού των πρωτεϊνικών πολυκρυσταλλικών ιζημάτων. Παράλληλα διεξήχθησαν και πειράματα περίθλασης ακτίνων-Χ από μονοκρυσταλλικά δείγματα (Single crystal diffraction) ώστε να εξαχθούν περαιτέρω πληροφορίες χρησιμοποιώντας συνδυαστικά τις δυο τεχνικές. Από τη μελέτη συγκρυστάλλωσης της ινσουλίνης με τους οργανικούς προσδέτες, προσδιορίστηκαν εκτενώς τα κρυσταλλογραφικά χαρακτηριστικά των πολυμόρφων που προέκυψαν, ενώ εξήχθησαν σημαντικά συμπεράσματα για τις διαμορφώσεις που λαμβάνει η ινσουλίνη παρουσία αυτών, καθώς και η φαρμακευτική σημασία τους. Ανάμεσα στα πολύμορφα που εντοπίσθηκαν, ταυτοποιήθηκαν δυο νέα πολύμορφα ινσουλίνης που χαρακτηρίζονται κρυσταλλογραφικά από πλεγματικές σταθερές που δεν έχουν καταχωρηθεί στην παγκόσμια τράπεζα πρωτεϊνικών δομών (Protein Data Bank) όπου και καταθέσαμε τις ακριβείς συντεταγμένες των πρωτεϊνικών δομών όπως προέκυψαν πειραματικά.
Για την εκπόνηση της μελέτης της επίδρασης του οξειδωτικού στρες στη δομή της ινσουλίνης, πραγματοποιήθηκε μελέτη και κατασκευή ενός καινοτόμου συστήματος επιτυχούς παραγωγής ελεύθερων ριζών με ελεγχόμενο ρυθμό, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της επίδρασης συγκεκριμένων ριζών σε ποικίλα πρωτεϊνικά συστήματα. Η ανάγκη αυτή προέκυψε καθώς το μοναδικό τεχνητό διαθέσιμο σύστημα παραγωγής ριζών (σύστημα Fenton) περιέχει παρεμβάλλοντα οξειδωτικά ή αντιοξειδωτικά συστατικά με αποτέλεσμα να μην επιτρέπει εξειδικευμένα την παραγωγή ελευθέρων ριζών και τη μελέτη της επίδρασής τους. Συγκεκριμένα από τη μελέτη στην ινσουλίνη, εντοπίσθηκαν κάποια από τα αμινοξέα που επηρεάζονται από τη ρίζα υδροξυλίου και ο βαθμός οξείδωσής τους συναρτήσει του χρόνου έκθεσης μέσω βιοχημικών τεχνικών, ενώ επιπλέον η ινσουλίνη εξετάσθηκε μέσω της κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ για τον εντοπισμό ενδεχόμενων αλλοιώσεων που προκαλούνται στη στερεοδιαμόρφωσή της. Ο εντοπισμός των αμινοξέων που επηρεάζονται μέγιστα από τη ρίζα υδροξυλίου αποτελεί σημαντικό εύρημα καθώς αντικατάσταση (μέσω μετάλλαξης ή χημικής σύνθεσης) των ευπρόσβλητων αμινοξέων, θα μπορούσε να προστατεύσει την ινσουλίνη καθιστώντας τη λειτουργική ακόμα και υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες.
Τέλος, στα πλαίσια του δομικού χαρακτηρισμού υλικών, πραγματοποιήθηκαν πειράματα περίθλασης ηλεκτρονίων με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διελεύσεως και την τεχνική της ηλεκτρονικής τομογραφίας (Manual Diffraction Tomography, MDT) σε υλικά υψηλού ερευνητικού ενδιαφέροντος λόγω των υπεραγώγιμων ιδιοτήτων τους, σε ορυκτά λιθίου, τα οποία παρουσιάζουν ιδιαίτερο γεωχημικό ενδιαφέρον, καθώς και σε δείγματα αρχαιολογικής σημασίας. Η τεχνική της μετάπτωσης ηλεκτρονικής δέσμης (Precession Electron Diffraction, PED) η οποία χρησιμοποιήθηκε συνδυαστικά με την ηλεκτρονική τομογραφία, μείωσε δραστικά το φαινόμενο της δυναμικής περίθλασης (ιδιαίτερα έντονο κατά την περίθλαση ηλεκτρονίων) επιτρέποντας τη σαφή καταγραφή ανακλάσεων στον τρισδιάστατο αντίστροφο χώρο και την εξαγωγή δομικής πληροφορίας με μεγάλη ακρίβεια. |
| author2 |
Μαργιωλάκη, Ειρήνη |
| author_facet |
Μαργιωλάκη, Ειρήνη Καραβασίλη, Φωτεινή |
| format |
Thesis |
| author |
Καραβασίλη, Φωτεινή |
| author_sort |
Καραβασίλη, Φωτεινή |
| title |
Ανάπτυξη και συνδυασμός μεθόδων περίθλασης ακτίνων-Χ και ηλεκτρονίων για το δομικό χαρακτηρισμό νανοκρυσταλλικών υλικών |
| title_short |
Ανάπτυξη και συνδυασμός μεθόδων περίθλασης ακτίνων-Χ και ηλεκτρονίων για το δομικό χαρακτηρισμό νανοκρυσταλλικών υλικών |
| title_full |
Ανάπτυξη και συνδυασμός μεθόδων περίθλασης ακτίνων-Χ και ηλεκτρονίων για το δομικό χαρακτηρισμό νανοκρυσταλλικών υλικών |
| title_fullStr |
Ανάπτυξη και συνδυασμός μεθόδων περίθλασης ακτίνων-Χ και ηλεκτρονίων για το δομικό χαρακτηρισμό νανοκρυσταλλικών υλικών |
| title_full_unstemmed |
Ανάπτυξη και συνδυασμός μεθόδων περίθλασης ακτίνων-Χ και ηλεκτρονίων για το δομικό χαρακτηρισμό νανοκρυσταλλικών υλικών |
| title_sort |
ανάπτυξη και συνδυασμός μεθόδων περίθλασης ακτίνων-χ και ηλεκτρονίων για το δομικό χαρακτηρισμό νανοκρυσταλλικών υλικών |
| publishDate |
2018 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/11514 |
| work_keys_str_mv |
AT karabasilēphōteinē anaptyxēkaisyndyasmosmethodōnperithlasēsaktinōnchkaiēlektroniōngiatodomikocharaktērismonanokrystallikōnylikōn AT karabasilēphōteinē designandimplementationofxrayandelectrondiffractionmethodsforthestructuralcharacterisationofnanocrystallinematerials |
| _version_ |
1771297244604006400 |
| spelling |
nemertes-10889-115142022-09-05T14:07:13Z Ανάπτυξη και συνδυασμός μεθόδων περίθλασης ακτίνων-Χ και ηλεκτρονίων για το δομικό χαρακτηρισμό νανοκρυσταλλικών υλικών Design and implementation of X-ray and electron diffraction methods for the structural characterisation of nanocrystalline materials Καραβασίλη, Φωτεινή Μαργιωλάκη, Ειρήνη Γεωργίου, Χρήστος Κατσώρης, Παναγιώτης Καλπαξής, Δημήτριος Κοκκινίδης, Μιχαήλ Ροσμαράκη, Ελευθερία Δημαρόγκωνα, Μαρία Karavassili, Fotini Κρυσταλλογραφία Δομική βιολογία Ακτινοβολία σύγχροτρον Ινσουλίνη Διαβήτης Οξειδωτικό στρες Crystallography Structural biology Synchrotron radiation Insulin Diabetes Oxidative stress 572.565 Η συγκεκριμένη Διδακτορική Διατριβή αφορά στην ανάπτυξη και εφαρμογή καινοτόμων μεθοδολογιών για τον δομικό χαρακτηρισμό υλικών εστιάζοντας σε πρωτεΐνες φαρμακευτικού ενδιαφέροντος. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μελέτη του πολυμορφισμού της ινσουλίνης και επίλυση της δομής πολυμόρφων της μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πολυάριθμα πειράματα κρυστάλλωσης της ινσουλίνης υπό διαφορετικές συνθήκες (pH, οργανικοί προσδέτες). Επιπλέον πραγματοποιήθηκε μελέτη της επίδρασης του οξειδωτικού στρες στη δομή της ανθρώπινης ινσουλίνης, για τη μελέτη της οποίας καταστευάσθηκε εκ νέου σύστημα ελεγχόμενης παραγωγής ελεύθερων ριζών. Η τελευταία μελέτη πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με την ομάδα Βιοχημείας του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου & Ανάπτυξης, του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Οι κρύσταλλοι ινσουλίνης που προέκυψαν είτε μεταβάλλοντας τις συνθήκες κρυστάλλωσης είτε λόγω του οξειδωτικού στρες, μελετήθηκαν μέσω της περίθλασης ακτίνων-Χ αρχικά με τη χρήση εργαστηριακού περιθλασίμετρου και στη συνέχεια στο Ευρωπαϊκό σύγχροτρον, ESRF, της Γαλλίας. Η βασική τεχνική που ακολουθήθηκε για τα πειράματα κρυσταλλογραφίας ήταν η περίθλαση ακτίνων-Χ από πολυκρυσταλλικά δείγματα (X-Ray Powder Diffraction-XRPD), η οποία τα τελευταία χρόνια έχει αναδειχθεί σε ένα σημαντικό εργαλείο χαρακτηρισμού των πρωτεϊνικών πολυκρυσταλλικών ιζημάτων. Παράλληλα διεξήχθησαν και πειράματα περίθλασης ακτίνων-Χ από μονοκρυσταλλικά δείγματα (Single crystal diffraction) ώστε να εξαχθούν περαιτέρω πληροφορίες χρησιμοποιώντας συνδυαστικά τις δυο τεχνικές. Από τη μελέτη συγκρυστάλλωσης της ινσουλίνης με τους οργανικούς προσδέτες, προσδιορίστηκαν εκτενώς τα κρυσταλλογραφικά χαρακτηριστικά των πολυμόρφων που προέκυψαν, ενώ εξήχθησαν σημαντικά συμπεράσματα για τις διαμορφώσεις που λαμβάνει η ινσουλίνη παρουσία αυτών, καθώς και η φαρμακευτική σημασία τους. Ανάμεσα στα πολύμορφα που εντοπίσθηκαν, ταυτοποιήθηκαν δυο νέα πολύμορφα ινσουλίνης που χαρακτηρίζονται κρυσταλλογραφικά από πλεγματικές σταθερές που δεν έχουν καταχωρηθεί στην παγκόσμια τράπεζα πρωτεϊνικών δομών (Protein Data Bank) όπου και καταθέσαμε τις ακριβείς συντεταγμένες των πρωτεϊνικών δομών όπως προέκυψαν πειραματικά. Για την εκπόνηση της μελέτης της επίδρασης του οξειδωτικού στρες στη δομή της ινσουλίνης, πραγματοποιήθηκε μελέτη και κατασκευή ενός καινοτόμου συστήματος επιτυχούς παραγωγής ελεύθερων ριζών με ελεγχόμενο ρυθμό, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της επίδρασης συγκεκριμένων ριζών σε ποικίλα πρωτεϊνικά συστήματα. Η ανάγκη αυτή προέκυψε καθώς το μοναδικό τεχνητό διαθέσιμο σύστημα παραγωγής ριζών (σύστημα Fenton) περιέχει παρεμβάλλοντα οξειδωτικά ή αντιοξειδωτικά συστατικά με αποτέλεσμα να μην επιτρέπει εξειδικευμένα την παραγωγή ελευθέρων ριζών και τη μελέτη της επίδρασής τους. Συγκεκριμένα από τη μελέτη στην ινσουλίνη, εντοπίσθηκαν κάποια από τα αμινοξέα που επηρεάζονται από τη ρίζα υδροξυλίου και ο βαθμός οξείδωσής τους συναρτήσει του χρόνου έκθεσης μέσω βιοχημικών τεχνικών, ενώ επιπλέον η ινσουλίνη εξετάσθηκε μέσω της κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ για τον εντοπισμό ενδεχόμενων αλλοιώσεων που προκαλούνται στη στερεοδιαμόρφωσή της. Ο εντοπισμός των αμινοξέων που επηρεάζονται μέγιστα από τη ρίζα υδροξυλίου αποτελεί σημαντικό εύρημα καθώς αντικατάσταση (μέσω μετάλλαξης ή χημικής σύνθεσης) των ευπρόσβλητων αμινοξέων, θα μπορούσε να προστατεύσει την ινσουλίνη καθιστώντας τη λειτουργική ακόμα και υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες. Τέλος, στα πλαίσια του δομικού χαρακτηρισμού υλικών, πραγματοποιήθηκαν πειράματα περίθλασης ηλεκτρονίων με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διελεύσεως και την τεχνική της ηλεκτρονικής τομογραφίας (Manual Diffraction Tomography, MDT) σε υλικά υψηλού ερευνητικού ενδιαφέροντος λόγω των υπεραγώγιμων ιδιοτήτων τους, σε ορυκτά λιθίου, τα οποία παρουσιάζουν ιδιαίτερο γεωχημικό ενδιαφέρον, καθώς και σε δείγματα αρχαιολογικής σημασίας. Η τεχνική της μετάπτωσης ηλεκτρονικής δέσμης (Precession Electron Diffraction, PED) η οποία χρησιμοποιήθηκε συνδυαστικά με την ηλεκτρονική τομογραφία, μείωσε δραστικά το φαινόμενο της δυναμικής περίθλασης (ιδιαίτερα έντονο κατά την περίθλαση ηλεκτρονίων) επιτρέποντας τη σαφή καταγραφή ανακλάσεων στον τρισδιάστατο αντίστροφο χώρο και την εξαγωγή δομικής πληροφορίας με μεγάλη ακρίβεια. The present PhD thesis focuses on the development and application of innovative methodologies for structural characterization of materials with emphasis on proteins of pharmaceutical interest. Specifically, the polymorphism of human insulin molecule has been extensively studied and the structure of specific insulin polymorphs has been solved using X-ray crystallography. For the purpose of this thesis, several crystallization experiments of insulin have been performed under various conditions (pH, organic ligands). Additionally the effect of oxidative stress on insulin’s structure has been examined as well (Chapters 2 & 7), after constructing successfully an innovative system for artificially producing hydroxyl radicals. The later study has been performed in collaboration with the Biochemistry research group, of the section of Genetics, Cell Biology & Development, Department of Biology, at the University of Patras. The crystals obtained from the above mentioned crystallisations were employed in several X-ray diffraction experiments, which were initially performed using a laboratory source and later on at the European Synchrotron Radiation Facility, ESRF, in France. The main technique employed for the crystallographic studies was the X- Ray powder diffraction (XRPD) method, which has been proven to be an important tool for determining the properties and structure of polycrystalline protein precipitants during the last decade. In parallel, some single crystal X-ray diffraction experiments have been performed as well in order to validate our results and extract further information by combining both the two techniques. Our results regarding insulin’s co-crystallisation with ligands include the complete characterization of all insulin polymorphs obtained, whereas the distinct insulin conformations observed and their potential pharmaceutical importance have been stated. Among the various polymorphs obtained, two novel insulin crystalline polymorphs have been identified with unit cell parameters which have not been published before and thus their three dimensional structures have been deposited in Protein Data Bank. Regarding the impact that oxidative stress and more specifically of hydroxyl (˙OH) radicals, on insulin’s structure, the design and the construction of an innovative system for artificially producing hydroxyl radicals has been successfully built and can be furthermore applied to investigate several protein systems. The need for constructing such system has arisen from the fact that the only available artificial in vitro ˙OH production system used nowadays, is the Fenton system or its variants. However, all these systems are not providing specifically only the ˙OH radical, as other forms of ROS (Reactive Oxygen Species) exist and more importantly reduced/oxidized metal ions, antioxidants and ˙OH scavengers coexist in the same system. Thus, with such systems it wouldn’t be possible to produce exclusively selected radicals and isolate their effect on the proteins studied. Our results, after exposing human insulin to the novel suggested system, demonstrate some amino acids which have undergone changes due to hydroxyl radicals’ presence whereas the oxidation level versus exposure time has been defined, as obtained through spectrophotometry and fluorescence spectroscopy. In addition the effects caused in the three dimensional structure of human insulin have been examined through X- ray crystallography. By identifying some sensitiveto- radicals amino acids we can suggest the development of insulin analogues having amino acids least prone to radicals so that insulin can remain functional even under conditions of oxidative stress. Lastly, in terms of characterizing materials structurally, several diffraction experiments have been performed using transmission electron microscopy and the Manual Diffraction Tomography (MDT) method, for characterizing materials of high scientific importance due to their superconducting properties, li lithium-rich minerals of great geochemical importance, as well as samples of high archaeological importance. The Precession Electron Diffraction (PED) method and the diffraction tomography were combined in order to drastically reduce the dynamical scattering effect (particularly intense during electron diffraction), allowing to correctly record the reflections in three dimensional reciprocal space and extract accurate structural information. 2018-08-28T08:49:57Z 2018-08-28T08:49:57Z 2018-02-08 Thesis http://hdl.handle.net/10889/11514 gr Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. 6 application/pdf |
