Σχεδιασμός, έκφραση και δομικές μελέτες τμημάτων του ανθρώπινου νευρωνικού νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης
Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στους υποδοχείς Cys-θηλιάς, που διαμεσολαβούν και ρυθμίζουν την ταχεία συναπτική νευροδιαβίβαση. Είναι πενταμερή κανάλια ιόντων που ενεργοποιούνται από προσδέτη και απαρτίζονται από πέντε ομόλογες υπομονάδες, καθεμία εκ των οποίων περιλαμβάνει...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2018
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/11554 |
| id |
nemertes-10889-11554 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης Πενταμερή ιοντικά κανάλια που ενεργοποιούνται από προσδέτη Βιοχημεία μεμβρανικών πρωτεϊνών Δομική βιολογία Σχεδιασμός πρωτεϊνικών κατασκευών Nicotinic acetylcholine receptors Pentameric ligand-gated ion channels Membrane protein biochemistry Structural biology Protein engineering 612.804 2 |
| spellingShingle |
Νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης Πενταμερή ιοντικά κανάλια που ενεργοποιούνται από προσδέτη Βιοχημεία μεμβρανικών πρωτεϊνών Δομική βιολογία Σχεδιασμός πρωτεϊνικών κατασκευών Nicotinic acetylcholine receptors Pentameric ligand-gated ion channels Membrane protein biochemistry Structural biology Protein engineering 612.804 2 Ζαρκάδας, Ελευθέριος Σχεδιασμός, έκφραση και δομικές μελέτες τμημάτων του ανθρώπινου νευρωνικού νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης |
| description |
Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στους υποδοχείς Cys-θηλιάς, που διαμεσολαβούν και ρυθμίζουν την ταχεία συναπτική νευροδιαβίβαση. Είναι πενταμερή κανάλια ιόντων που ενεργοποιούνται από προσδέτη και απαρτίζονται από πέντε ομόλογες υπομονάδες, καθεμία εκ των οποίων περιλαμβάνει μία αμινοτελική εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), μια διαμεμβρανική περιοχή και μία κυτταροπλασματική περιοχή. Στις διεπαφές των ΕΚΠ των υπομονάδων του nAChR, εδράζεται η θέση πρόσδεσης του νευροδιαβιβαστή (ορθοστερική θέση), όπου μία α υπομονάδα συμμετέχει ως «κύρια» και η γειτονική της ως «συμπληρωματική».
Μέχρι πρόσφατα, οι γνώσεις μας σχετικά με την δομή των νευρωνικών nAChRs προέρχονταν κυρίως από τον χαρακτηρισμό ομόλογων πρωτεϊνών. Η λεπτομερής γνώση της δομής τους αναμένεται να βοηθήσει καθοριστικά στην κατανόηση του μηχανισμού λειτουργίας τους, αλλά και στην ανάπτυξη φαρμάκων για την θεραπεία των διαταραχών με τις οποίες σχετίζονται, που συμπεριλαμβάνουν νευρολογικές και ψυχιατρικές διαταραχές τον εθισμό σε ουσίες, τη φλεγμονή και τον πόνο.
Οι υπότυποι των nAChRs στους οποίους συμμετέχει η α9 υπομονάδα (α9*nAChRs) περιλαμβάνουν είτε ομοπενταμερείς α9 είτε ετεροπενταμερείς α9α10 υποδοχείς. Οι α9*nAChRs συγκεντρώνουν αυξανόμενο ενδιαφέρον, λόγω της εμπλοκής τους στην ρύθμιση πρώιμων διεργασιών της φλεγμονής, αλλά και επειδή έχουν αναδειχθεί ως υποσχόμενοι φαρμακευτικοί στόχοι, κυρίως για την θεραπεία του χρόνιου πόνου. Στην βιβλιογραφία, αναφέρονται δυσκολίες στην έκφραση της α9 υπομονάδας, που μετριάζονται, όταν αυτή συνεκφράζεται με την α10, ενώ δεν έχουν αναφερθεί περιπτώσεις που να επιτρέπουν αναλυτικές δομικές μελέτες.
Καθώς η έκφραση και απομόνωση ολόκληρου του υποδοχέα έχει αποδειχθεί πρόκληση, στην παρούσα διατριβή, έγινε έκφραση και βιοχημική μελέτη επιμέρους περιοχών των α9*nAChRs. Με απώτερο στόχο να καταστεί δυνατή η δομική μελέτη τους, ακολουθήθηκαν δύο στρατηγικές, (α) έκφραση της α9-ΕΚΠ ή της α10-ΕΚΠ ως υδατοδιαλυτής πρωτεΐνης και (β) κατασκευή και έκφραση «κολοβών» μορφών των υποδοχέων, όπου έχουν απαλειφθεί τμήματα της κυτταροπλασματικής περιοχής.
Η αγρίου τύπου α9-ΕΚΠ εκφράστηκε στον ζυμομύκητα Pichia pastoris και, μέσω χρωματογραφικών μεθόδων, απομονώθηκε ένας ομοιογενής πληθυσμός μονομερών της γλυκοπρωτεΐνης ή της ενζυμικά απογλυκοζυλιωμένης μορφής της. Η μονομερής α9-ΕΚΠ δεν περιλαμβάνει ολοκληρωμένη ορθοστερική θέση πρόσδεσης, ωστόσο ο φαρμακολογικός χαρακτηρισμός της έδειξε ότι, παρότι μονομερής, διατηρεί σε μεγάλο βαθμό την συγγένειά της για διάφορους υποκαταστάτες, σε σχέση με τους φυσικούς α9*nAChRs, ειδικά για τους ανταγωνιστές α-μπουγκαροτοξίνη (α-Bgtx), μεθυλ-λυκακονιτίνη (MLA) και d-τουμποκουραρίνη. Έτσι, αναδείχθηκε ο καίριος ρόλος της κύριας πλευράς της ορθοστερικής θέσης στην πρόσδεση υποκαταστατών.
Από δοκιμές κρυστάλλωσης, λήφθηκαν κρύσταλλοι της απογλυκοζυλιωμένης α9-ΕΚΠ απουσία υποκαταστάτη ή παρουσία MLA ή α-Bgtx, που οδήγησαν, μετά από πειράματα περίθλασης ακτίνων-Χ, στην επίλυση της δομής της αποπρωτεΐνης α9-ΕΚΠ και των συμπλόκων της με MLA ή α-Bgtx, σε ανάλυση 1.8 Å, 1.7 Å και 2.7 Å, αντίστοιχα. Οι δομές αυτές αποτελούν τις πρώτες δομές που έχουν αναφερθεί για μια εξωκυττάρια περιοχή νευρωνικού nAChR. Η δομή της α9-ΕΚΠ, παρότι μονομερής και υδατοδιαλυτή, παρουσιάζει εντυπωσιακή ομοιότητα με ομόλογες πρωτεΐνες σε διαμόρφωση πενταμερούς, υποδεικνύοντας ότι η διαμόρφωσή της αντικατοπτρίζει αυτήν στους φυσικούς nAChRs. Στις δομές των συμπλόκων, ο προσανατολισμός των ανταγωνιστών σε σχέση με την α9-ΕΚΠ και το μοτίβο των αλληλεπιδράσεών τους είναι αντίστοιχα αυτών που παρατηρήθηκαν στα σύμπλοκά τους με ομόλογες πενταμερείς πρωτεΐνες, υπογραμμίζοντας περαιτέρω τον πρωταγωνιστικό ρόλο της κύριας πλευράς της ορθοστερικής θέσης στην πρόσδεση των υποκαταστατών.
Η α10-ΕΚΠ (με μία μεταλλαγή, ώστε να ενισχυθεί η υδροφιλικότητα του μορίου) εκφράστηκε, σε P. pastoris, ως συσσωματώματα μεγάλου μοριακού βάρους και σε μικρό ποσοστό ως μονομερές, καθιστώντας την μη ελκυστική για δομικές μελέτες. Η έκφραση των μεμβρανικών κατασκευών της α9 σε βακτήρια, σε P. pastoris ή σε κύτταρα εντόμων (Sf9), αλλά και η συνέκφραση κολοβών μορφών των α9 και α10 σε Sf9, απέτυχαν να οδηγήσουν στην απομόνωση ενός σταθερού και ομοιογενούς πληθυσμού πενταμερών, όπως απαιτούν οι δομικές μελέτες.
Μετά από σχεδιασμό και έκφραση σε Sf9, μιας κολοβής μορφής της α9 (α9Μ), με πιο μετριοπαθείς τροποποιήσεις στην κυτταροπλασματική περιοχή σε σχέση με τις προαναφερθείσες, επιτεύχθηκε η απομόνωση ενός σταθερού πληθυσμού πενταμερών, με ικανότητα πρόσδεσης της α-Bgtx, υποδεικνύοντας ότι οι διαλυτοποιημένοι υποδοχείς διατηρούν μερικώς την λειτουργικότητά τους. Η μεθοδολογία, που αναπτύχθηκε για την απομόνωση ομοπενταμερών υποδοχέων της α9Μ, θέτει τα θεμέλια για την δομική μελέτη διαμεμβρανικών α9 nAChRs είτε μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ είτε με ηλεκτρονική κρυο-μικροσκοπία. |
| author2 |
Πουλάς, Κωνσταντίνος |
| author_facet |
Πουλάς, Κωνσταντίνος Ζαρκάδας, Ελευθέριος |
| format |
Thesis |
| author |
Ζαρκάδας, Ελευθέριος |
| author_sort |
Ζαρκάδας, Ελευθέριος |
| title |
Σχεδιασμός, έκφραση και δομικές μελέτες τμημάτων του ανθρώπινου νευρωνικού νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης |
| title_short |
Σχεδιασμός, έκφραση και δομικές μελέτες τμημάτων του ανθρώπινου νευρωνικού νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης |
| title_full |
Σχεδιασμός, έκφραση και δομικές μελέτες τμημάτων του ανθρώπινου νευρωνικού νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης |
| title_fullStr |
Σχεδιασμός, έκφραση και δομικές μελέτες τμημάτων του ανθρώπινου νευρωνικού νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης |
| title_full_unstemmed |
Σχεδιασμός, έκφραση και δομικές μελέτες τμημάτων του ανθρώπινου νευρωνικού νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης |
| title_sort |
σχεδιασμός, έκφραση και δομικές μελέτες τμημάτων του ανθρώπινου νευρωνικού νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης |
| publishDate |
2018 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/11554 |
| work_keys_str_mv |
AT zarkadaseleutherios schediasmosekphrasēkaidomikesmeletestmēmatōntouanthrōpinouneurōnikounikotinikouypodocheaaketylocholinēs AT zarkadaseleutherios designexpressionandstructuralstudiesofdomainsofthehumanneuronalnicotinicacetylcholinereceptor |
| _version_ |
1771297160739946496 |
| spelling |
nemertes-10889-115542022-09-05T05:39:01Z Σχεδιασμός, έκφραση και δομικές μελέτες τμημάτων του ανθρώπινου νευρωνικού νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης Design, expression and structural studies of domains of the human neuronal nicotinic acetylcholine receptor Ζαρκάδας, Ελευθέριος Πουλάς, Κωνσταντίνος Όρκουλα, Μαλβίνα Πατρινός, Γεώργιος Σπυρούλιας, Γεώργιος Σταθόπουλος, Κωνσταντίνος Ηλιόπουλος, Ηλίας Ζησιμοπούλου, Παρασκευή Zarkadas, Eleftherios Νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης Πενταμερή ιοντικά κανάλια που ενεργοποιούνται από προσδέτη Βιοχημεία μεμβρανικών πρωτεϊνών Δομική βιολογία Σχεδιασμός πρωτεϊνικών κατασκευών Nicotinic acetylcholine receptors Pentameric ligand-gated ion channels Membrane protein biochemistry Structural biology Protein engineering 612.804 2 Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στους υποδοχείς Cys-θηλιάς, που διαμεσολαβούν και ρυθμίζουν την ταχεία συναπτική νευροδιαβίβαση. Είναι πενταμερή κανάλια ιόντων που ενεργοποιούνται από προσδέτη και απαρτίζονται από πέντε ομόλογες υπομονάδες, καθεμία εκ των οποίων περιλαμβάνει μία αμινοτελική εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), μια διαμεμβρανική περιοχή και μία κυτταροπλασματική περιοχή. Στις διεπαφές των ΕΚΠ των υπομονάδων του nAChR, εδράζεται η θέση πρόσδεσης του νευροδιαβιβαστή (ορθοστερική θέση), όπου μία α υπομονάδα συμμετέχει ως «κύρια» και η γειτονική της ως «συμπληρωματική». Μέχρι πρόσφατα, οι γνώσεις μας σχετικά με την δομή των νευρωνικών nAChRs προέρχονταν κυρίως από τον χαρακτηρισμό ομόλογων πρωτεϊνών. Η λεπτομερής γνώση της δομής τους αναμένεται να βοηθήσει καθοριστικά στην κατανόηση του μηχανισμού λειτουργίας τους, αλλά και στην ανάπτυξη φαρμάκων για την θεραπεία των διαταραχών με τις οποίες σχετίζονται, που συμπεριλαμβάνουν νευρολογικές και ψυχιατρικές διαταραχές τον εθισμό σε ουσίες, τη φλεγμονή και τον πόνο. Οι υπότυποι των nAChRs στους οποίους συμμετέχει η α9 υπομονάδα (α9*nAChRs) περιλαμβάνουν είτε ομοπενταμερείς α9 είτε ετεροπενταμερείς α9α10 υποδοχείς. Οι α9*nAChRs συγκεντρώνουν αυξανόμενο ενδιαφέρον, λόγω της εμπλοκής τους στην ρύθμιση πρώιμων διεργασιών της φλεγμονής, αλλά και επειδή έχουν αναδειχθεί ως υποσχόμενοι φαρμακευτικοί στόχοι, κυρίως για την θεραπεία του χρόνιου πόνου. Στην βιβλιογραφία, αναφέρονται δυσκολίες στην έκφραση της α9 υπομονάδας, που μετριάζονται, όταν αυτή συνεκφράζεται με την α10, ενώ δεν έχουν αναφερθεί περιπτώσεις που να επιτρέπουν αναλυτικές δομικές μελέτες. Καθώς η έκφραση και απομόνωση ολόκληρου του υποδοχέα έχει αποδειχθεί πρόκληση, στην παρούσα διατριβή, έγινε έκφραση και βιοχημική μελέτη επιμέρους περιοχών των α9*nAChRs. Με απώτερο στόχο να καταστεί δυνατή η δομική μελέτη τους, ακολουθήθηκαν δύο στρατηγικές, (α) έκφραση της α9-ΕΚΠ ή της α10-ΕΚΠ ως υδατοδιαλυτής πρωτεΐνης και (β) κατασκευή και έκφραση «κολοβών» μορφών των υποδοχέων, όπου έχουν απαλειφθεί τμήματα της κυτταροπλασματικής περιοχής. Η αγρίου τύπου α9-ΕΚΠ εκφράστηκε στον ζυμομύκητα Pichia pastoris και, μέσω χρωματογραφικών μεθόδων, απομονώθηκε ένας ομοιογενής πληθυσμός μονομερών της γλυκοπρωτεΐνης ή της ενζυμικά απογλυκοζυλιωμένης μορφής της. Η μονομερής α9-ΕΚΠ δεν περιλαμβάνει ολοκληρωμένη ορθοστερική θέση πρόσδεσης, ωστόσο ο φαρμακολογικός χαρακτηρισμός της έδειξε ότι, παρότι μονομερής, διατηρεί σε μεγάλο βαθμό την συγγένειά της για διάφορους υποκαταστάτες, σε σχέση με τους φυσικούς α9*nAChRs, ειδικά για τους ανταγωνιστές α-μπουγκαροτοξίνη (α-Bgtx), μεθυλ-λυκακονιτίνη (MLA) και d-τουμποκουραρίνη. Έτσι, αναδείχθηκε ο καίριος ρόλος της κύριας πλευράς της ορθοστερικής θέσης στην πρόσδεση υποκαταστατών. Από δοκιμές κρυστάλλωσης, λήφθηκαν κρύσταλλοι της απογλυκοζυλιωμένης α9-ΕΚΠ απουσία υποκαταστάτη ή παρουσία MLA ή α-Bgtx, που οδήγησαν, μετά από πειράματα περίθλασης ακτίνων-Χ, στην επίλυση της δομής της αποπρωτεΐνης α9-ΕΚΠ και των συμπλόκων της με MLA ή α-Bgtx, σε ανάλυση 1.8 Å, 1.7 Å και 2.7 Å, αντίστοιχα. Οι δομές αυτές αποτελούν τις πρώτες δομές που έχουν αναφερθεί για μια εξωκυττάρια περιοχή νευρωνικού nAChR. Η δομή της α9-ΕΚΠ, παρότι μονομερής και υδατοδιαλυτή, παρουσιάζει εντυπωσιακή ομοιότητα με ομόλογες πρωτεΐνες σε διαμόρφωση πενταμερούς, υποδεικνύοντας ότι η διαμόρφωσή της αντικατοπτρίζει αυτήν στους φυσικούς nAChRs. Στις δομές των συμπλόκων, ο προσανατολισμός των ανταγωνιστών σε σχέση με την α9-ΕΚΠ και το μοτίβο των αλληλεπιδράσεών τους είναι αντίστοιχα αυτών που παρατηρήθηκαν στα σύμπλοκά τους με ομόλογες πενταμερείς πρωτεΐνες, υπογραμμίζοντας περαιτέρω τον πρωταγωνιστικό ρόλο της κύριας πλευράς της ορθοστερικής θέσης στην πρόσδεση των υποκαταστατών. Η α10-ΕΚΠ (με μία μεταλλαγή, ώστε να ενισχυθεί η υδροφιλικότητα του μορίου) εκφράστηκε, σε P. pastoris, ως συσσωματώματα μεγάλου μοριακού βάρους και σε μικρό ποσοστό ως μονομερές, καθιστώντας την μη ελκυστική για δομικές μελέτες. Η έκφραση των μεμβρανικών κατασκευών της α9 σε βακτήρια, σε P. pastoris ή σε κύτταρα εντόμων (Sf9), αλλά και η συνέκφραση κολοβών μορφών των α9 και α10 σε Sf9, απέτυχαν να οδηγήσουν στην απομόνωση ενός σταθερού και ομοιογενούς πληθυσμού πενταμερών, όπως απαιτούν οι δομικές μελέτες. Μετά από σχεδιασμό και έκφραση σε Sf9, μιας κολοβής μορφής της α9 (α9Μ), με πιο μετριοπαθείς τροποποιήσεις στην κυτταροπλασματική περιοχή σε σχέση με τις προαναφερθείσες, επιτεύχθηκε η απομόνωση ενός σταθερού πληθυσμού πενταμερών, με ικανότητα πρόσδεσης της α-Bgtx, υποδεικνύοντας ότι οι διαλυτοποιημένοι υποδοχείς διατηρούν μερικώς την λειτουργικότητά τους. Η μεθοδολογία, που αναπτύχθηκε για την απομόνωση ομοπενταμερών υποδοχέων της α9Μ, θέτει τα θεμέλια για την δομική μελέτη διαμεμβρανικών α9 nAChRs είτε μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ είτε με ηλεκτρονική κρυο-μικροσκοπία. Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are pentameric ligand-gated ion channels of the Cys-loop superfamily. Cys-loop receptors mediate and regulate fast neurotransmission. They are ion channels of five homologous subunits, each comprising an N-terminal extracellular domain (ECD), a transmembrane domain and an intracellular domain (ICD). The neurotransmitter (orthosteric) binding site is extracellularly located and formed at the interface of adjacent subunits by two components: the principal and the complementary sides, which, in nAChRs, are conferred by an α subunit and a neighboring (α or non α) subunit, respectively. Until recently, our understanding of neuronal nAChRs structure was largely limited to insights from structures of homologous proteins. Structures of nAChRs would be instrumental to understand their physiology and to aid development of selective drugs to treat conditions that implicate nAChR dysfunction and include neurological and psychiatric disorders, substance addiction, inflammation and pain. The α9 subunit of neuronal nAChRs either forms homopentamers or, in association with α10, heteropentamers. Recently, α9-containing receptors (α9*nAChRs) have emerged as important players in pro-inflammatory pathways and in the treatment of chronic pain. In literature, heterologous expression of α9*nAChRs has been reported as challenging, while there are no reports of successful expression of α9*nAChRs, amenable to structural studies. Difficulties in obtaining sufficient quantities of receptor suitable for structural studies pose a major barrier towards that goal. Therefore, this study includes expression and biochemical characterization of selected domains of α9*nAChRs. In order to produce such domains, ultimately aiming at structural studies, two strategies were followed: (i) expression of water-soluble forms of either α9-ECD or α10-ECD and (ii) design, construction and expression of truncated forms of α9 and α10 subunits, engineered at their ICD, so as to obtain membrane-embedded forms of α9 or α9α10 nAChRs. The α9-ECD was expressed in yeast Pichia pastoris and, through chromatographic analysis, a homogeneous monomeric population was isolated for the glycoprotein or, following enzymatic treatment, its deglycosylated form, as well. The monomeric α9-ECD does not include a fully formed orthosteric binding site. Nevertheless, its pharmacological characterization showed that it retains moderate to high binding affinity for several cholinergic ligands, often comparable to those observed for native α9*nAChRs, especially for the antagonists d-tubocurarine, α-bungarotoxin (α-Bgtx) and methyllycaconitine (MLA). These results highlight the major contribution of the principal side of the orthosteric binding site to ligand binding. Crystallisation trials of the deglycosylated monomeric α9-ECD, in the absence of ligands or in the presence of MLA or α-Bgtx, resulted to the formation of X-ray diffracting crystals, that finally led to the determination of the crystal structures of the α9-ECD, in its ligand-free state and in its complexes with MLA or α-Bgtx, at resolutions of 1.8 Å, 1.7 Å and 2.7 Å, respectively. These structures were the first to be reported for a neuronal nAChR ECD. The crystal structure of the α9-ECD superimposed well with the corresponding domains of structures of homologous pentameric proteins, suggesting that the isolated ECD adopts native-like folding, despite the absence of the membrane domain or adjacent subunits. In the structures of its complexes, the interaction motifs of both antagonists and their orientation in the principal side of the orthosteric site were similar to those observed in their complexes with homologous proteins in pentameric assemblies, which display fully form binding sites, thus further highlighting the major contribution of the principal side of α9-ECD to their binding. Expression of α10-ECD (with a single mutation to enhance its solubility), in yeast Pichia pastoris, led to the formation of aggregates and only a small proportion of monomers, rendering it unattractive for further analysis. Regarding engineered receptors, expression of several α9 constructs in bacteria, yeast or Sf9 insect cells, as well as co-expression of α9 and α10 in Sf9, failed to lead to the isolation of a stable and homogeneous pentameric population, as required for structural studies. Subsequently, design and expression in Sf9, of another construct of α9 (α9Μ), with moderate truncation of the ICD, led to the successful isolation of a stable pentameric population that displays α-Bgtx binding, suggesting that detergent solubilized receptors partially retain their functionality. The methodology reported here for isolation of near intact homopentamers of α9Μ, which seem to be promising candidates for structural studies, should pave the way for future high-resolution studies of the α9 nAChR either by crystallographic or Electron cryo-Microscopy analysis. 2018-09-18T07:55:05Z 2018-09-18T07:55:05Z 2018-06-11 Thesis http://hdl.handle.net/10889/11554 gr Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. 0 application/pdf |
