Παραγωγή και δομικός χαρακτηρισμός ιικών πρωτεϊνών και φαρμακευτικών στόχων

• Κύριος συγγραφέας: Σπηλιοπούλου, Μαρία
• Άλλοι συγγραφείς: Μαργιωλάκη, Ειρήνη
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2018
• Θέματα: Περίθλαση ακτίνων-Χ; Ασκορβικό οξύ; Πρωτεϊνική παραγωγή; X-ray powder diffraction; Ascorbic acid; Protein expression and purification; Octreotide; 573.373 993 55

Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκαν πειράματα παραγωγής και κρυστάλλωσης ιικών πρωτεϊνών, συγκρυστάλλωση της ανθρώπινης ινσουλίνης με τον οργανικό προσδέτη ascorbic acid, αλλά και πειράματα κρυστάλλωσης του octreotide, ενός πεπτιδικού αναλόγου της σωματοστατίνης. Αυτά οδήγησαν στην επιτυχή παραγωγή πολυκρυσταλλικών δειγμάτων, κατάλληλων για μετρήσεις μέσω περίθλασης ακτίνων-Χ (XRPD), τόσο με τη χρήση εργαστηριακού περιθλασιμέτρου, όσο και με τη χρήση πηγών ακτινοβολίας σύγχροτρον και συγκεκριμένα του Ευρωπαϊκού Synchrotron (ESRF). Οι ιικές πρωτεάσες είναι πρωτεολυτικά ένζυμα που συντελούν στη σύνδεση ιικών τμημάτων κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής και του πολλαπλασιασμού του ιού. Στη μεταπτυχιακή διατριβή, παρουσιάζεται η έκφραση, απομόνωση, κρυστάλλωση και η πρωταρχική δομική ανάλυση μέσω περίθλασης ακτίνων-Χ της βασικής πρωτεάσης (3C) ενός επικίνδυνου για την ανθρώπινη υγεία εντεροϊού, του στελέχους Β3 του ιού Coxsackie, υπεύθυνου για πολλές περιπτώσεις ιικής μυοκαρδίτιδας. Πολυκρυσταλλικά πρωτεϊνικά δείγματα, κατάλληλα για μετρήσεις μέσω περίθλασης ακτίνων-Χ (XRPD), παρήχθησαν και ένα πολύμορφο μονοκλινούς συμμετρίας (space group C2) ταυτοποιήθηκε. Ακόμη, πειράματα πρωτεϊνικής παραγωγής αφορούσαν στην έκφραση και απομόνωση της πρωτεάσης κυστεΐνης τύπου 3C από τον Tobacco Etch Virus (TEV), TEVpro, αλλά και στην αξιοποίηση των πρωτεολυτικών ιδιοτήτων της λόγω αναγνώρισης της πρωτεολυτικής της αλληλουχίας στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη-στόχο, η οποία, στην περίπτωσή μας, αποτελεί μέλος του συμπλόκου αντιγραφής των φλαβοϊών∙ πρόκειται για την επικράτεια mRNA μεθυλτρανσφεράσης (MTase) της μη-δομικής πρωτεΐνης 5 (NS5) του ορότυπου 3 του παθογόνου φλαβοϊού, Dengue virus (DENV3). Συγκεκριμένα, οι μολύνσεις από φλαβοϊούς μπορούν να οδηγήσουν σε απειλητικές για τη ζωή ασθένειες. Γίνεται, επομένως, αντιληπτή η σπουδαιότητα της εκτεταμένης έρευνας που βρίσκεται αυτή τη στιγμή σε εξέλιξη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών εμβολίων και βελτιωμένων αντι-ιικών ενώσεων. Προς την κατεύθυνση αυτή, στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται η έκφραση, απομόνωση, κρυστάλλωση και η πρωταρχική δομική ανάλυση μέσω περίθλασης ακτίνων-Χ της επικράτειας mRNA μεθυλτρανσφεράσης (MTase) της μη-δομικής πρωτεΐνης 5 (NS5) του ορότυπου 3 Dengue virus (DENV3). Ένα πολύμορφο ορθορομβικής συμμετρίας (space group: P21212) ταυτοποιήθηκε. Δεδομένου ότι τα φυσικά ή τεχνητά παρασκευασμένα πεπτίδια βρίσκονται σήμερα στο επίκεντρο επιστημονικού ενδιαφέροντος παγκοσμίως, λόγω του ευρέος φάσματος των φαρμακευτικών και βιολογικών δραστηριοτήτων τους, σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε, επίσης την επιτυχή κρυστάλλωση και τη δομή υψηλής ανάλυσης του Octreotide, ενός σταθερού οκταπεπτιδικού αναλόγου της σωματοστατίνης, μιας από τις πιο ζωτικές ανθρώπινες πεπτιδικές ορμόνες. Το πολυκρυσταλλικό υλικό που προέκυψε έπειτα από πειράματα κρυστάλλωσης, οδήγησε μέσω XRPD μετρήσεων στη συλλογή δεδομένων περίθλασης, η ανάλυση των οποίων κατέληξε στην αναγνώριση της ορθορομβικής συμμετρίας της μοναδιαίας κυψελίδας (space group: P212121), μια διαδικασία, την οποία ακολούθησε αργότερα ο πλήρης δομικός χαρακτηρισμός του μορίου. Ακόμη πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις απόδοσης των κρυσταλλώσεων, αλλά και παραγωγή πολυκρυσταλλικού ιζήματος πεπτιδίου χαμηλότερης καθαρότητας, σημαίνοντας τη χρήση της κρυστάλλωσης ως μέσο καθαρισμού. Οι επιδράσεις των μικρών οργανικών μορίων στη δομή και τη λειτουργία της ανθρώπινης ινσουλίνης είναι μια περιοχή που προσελκύει μεγάλο επιστημονικό ενδιαφέρον παγκοσμίως, λόγω της δυνατότητας ενίσχυσης των φαρμακοκινητικών και φαρμακοδυναμικών προφίλ των φαρμάκων με βάση την ανθρώπινη ινσουλίνη (human insulin-HI). Στην παρούσα μελέτη, η ΗΙ συγκρυσταλλώθηκε με ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C). Πολυκρυσταλλικά ιζήματα παρήχθησαν επιτυχώς, μια διαδικασία η οποία ακολουθήθηκε από τον δομικό χαρακτηρισμό τους ως προς τη συμμετρία της μοναδιαίας κυψελίδας, με αποτέλεσμα την ταυτοποίηση δύο διαφορετικών πολυμόρφων ρομβοεδρικής συμμετρίας (space group: R3) μέσω XRPD. Η ανθρώπινη ινσουλίνη παρουσία του προσδέτη, σε κλίμακα pΗ: 5-6,5 υιοθετεί την μοριακή διαμόρφωση Τ6, ενώ, σε αλκαλικό ρΗ, ταυτοποιείται η διαμόρφωση T3R3f. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής επιδεικνύουν την αποδοτικότητα και ακρίβεια της μεθόδου XRPD για διαλογή πολυμόρφων και επίλυση δομών σε ένα εύρος συνθηκών κρυστάλλωσης μακρομορίων.