Η συμβολή της επαναντιγραφής στη γονιδιακή ενίσχυση και την εμφάνιση ανθεκτικότητας σε τοξικούς παράγοντες στο ζυμομύκητα Schizosaccharomyces pombe

• Κύριος συγγραφέας: Κασελίμη, Ειρήνη
• Άλλοι συγγραφείς: Λυγερού, Ζωή
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2018
• Θέματα: Σχιζοσακχαρομύκητας; Επαναντιγραφή; Γονιδιακή ενίσχυση; Γονιδιωματική αστάθεια; Εξέλιξη; Schizosaccharomyces pombe; Rereplication; Gene amplification; Genomic instability; Evolution; 572.864 5

Η εκκίνηση της αντιγραφής του ευκαρυωτικού γενετικού υλικού είναι μία διαδικασία δύο σταδίων. Κατά το πρώτο στάδιο, στις διάσπαρτες στο γονιδίωμα αφετηρίες, και με το τέλος της μίτωσης, δεσμεύονται πρωτεϊνικά σύμπλοκα τα οποία σταδιακά εμπλουτίζονται, καθώς πλησιάζει η μετάβαση G1/S. Τα σύμπλοκα αυτά είναι απαραίτητα για την εκκίνηση της αντιγραφής και η παρουσία τους στις αφετηρίες παρέχει την άδεια για έναρξη της αντιγραφής (αδειοδότηση). Ωστόσο, αυτή η άδεια δεν ταυτίζεται με την εκκίνηση της αντιγραφής. Προκειμένου αυτή να λάβει χώρα, θα πρέπει ορισμένες κρίσιμες υπομονάδες του συμπλόκου που φέρει πάνω της η αδειοδοτημένη αφετηρία να ενεργοποιηθούν μέσω φωσφορυλίωσης (δεύτερο στάδιο). Με αυτήν τη σταδιοποίηση της διαδικασίας εκκίνησης της αντιγραφής το κύτταρο εξασφαλίζει ότι κάθε αφετηρία της αντιγραφής θα ενεργοποιηθεί μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και ταυτόχρονα συντονίζει τη διαδοχή των φάσεων S και Μ. Απορρύθμιση της φυσιολογικής διαδικασίας αδειοδότησης της αντιγραφής προκαλεί επαναπυροδότηση αφετηριών κατά τη διάρκεια της ίδιας φάσης S και επαναντιγραφή του γονιδιώματος (re-replication). Η επαναντιγραφή προκαλεί βλάβες στο DNA οι οποίες σχετίζονται άμεσα με τη γονιδιωματική αστάθεια, την εμφάνιση δηλαδή αλλαγών/ανακατατάξεων στο γενετικό υλικό. Δεδομένου ότι με την επαναντιγραφή τοπικά κάποιες περιοχές του DNA εμφανίζονται σε πολλαπλά αντίγραφα επιδιώξαμε να διερευνήσουμε την πιθανή συμβολή της επαναντιγραφής στην εμφάνιση γονιδιακών διπλασιασμών και ενισχύσεων (gene duplications/amplifications). Προς αυτήν την κατεύθυνση χρησιμοποιήσαμε τον οργανισμό-μοντέλο Schizosaccharomyces pombe και μέσω δοκιμασιών ανθεκτικότητας σε δύο τοξικούς παράγοντες (αμινοτριαζόλη, χλωριούχο λίθιο) εκτιμήσαμε τη συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών αποικιών στην περίπτωση που τα κύτταρα αντέγραφαν φυσιολογικά το DNA τους και στην περίπτωση που είχε επαχθεί το φαινόμενο της επαναντιγραφής. Η επαναντιγραφή προκλήθηκε μέσω υπερέκφρασης του αδειοδοτικού παράγοντα Cdc18. Όπως διαπιστώθηκε μέσω Real-Time PCR, οι ανθεκτικές αποικίες που αναδύονται σε κάθε περίπτωση φέρουν σε πολλαπλά αντίγραφα γονίδια που σχετίζονται με την αντιμετώπιση του περιοριστικού παράγοντα (his5, sod2). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πειραμάτων μας, στην περίπτωση που είχε προηγηθεί επαναντιγραφή στα κύτταρα, εμφανίζονταν πολύ πιο συχνά ανθεκτικές στους τοξικούς παράγοντες αποικίες σε σχέση με την περίπτωση που η αντιγραφή διεξαγόταν φυσιολογικά. Επιπλέον, μελετήσαμε το ρόλο της πρωτεΐνης Rad3 στη συχνότητα εμφάνισης του φαινοτύπου ανθεκτικότητας. Η πρωτεΐνη αυτή είναι κομβική για την ενεργοποίηση σημείων ελέγχου που σταματούν τον κυτταρικό κύκλο, όταν υπάρχουν βλάβες στο γενετικό υλικό, προκειμένου να εκκινήσει η διαδικασία επιδιόρθωσής τους. Από τα πειράματα αυτά συμπεραίνουμε ότι η ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου είναι καταλυτική για την εμφάνιση ανθεκτικών αποικιών με αυξημένη συχνότητα μετά από επαναντιγραφή του DNA. Η ερευνητική αυτή εργασία παρέχει πειραματικά δεδομένα που αναδεικνύουν την επαναντιγραφή ως πιθανό μηχανισμό γένεσης γονιδιακών διπλασιασμών και ενισχύσεων με σημαντικές προεκτάσεις στην Εξελικτική Βιολογία αλλά και στη βιολογία ασθενειών του ανθρώπου.