| Περίληψη: | Η ριβονουκλεάση Ζ (RNase Z) είναι η υπεύθυνη ενδονουκλεάση για την αφαίρεση των 3’ ακόλουθων αλληλουχιών από τα πρόδρομα μόρια tRNA, ένα απαραίτητο βήμα όχι μόνο για τη βιογένεση των tRNAs αλλά επίσης για την παραγωγή μίας νέας ομάδας μικρών μη κωδικών μορίων RNA, τα οποία ονομάζονται tRNA-derived fragments (tRFs). Στον άνθρωπο υπάρχουν δύο μορφές RNase Z, η RNase ZL (92.2 kD) η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο ELAC2 και η RNase ZS (40kD) η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο ELAC1. H RNase ZL είναι υπεύθυνη για την ωρίμανση τόσο των πυρηνικών όσο και των μιτοχονδριακών RNA, για την παραγωγή tRFs της σειράς 1 καθώς και για την ωρίμανση σημαντικών μεγάλων μη κωδικών RNAs (lncRNAs) όπως το MALAT-1. Από την άλλη, η RNase ZS (ELAC1) έχει μέχρι τώρα απροσδιόριστο βιολογικό ρόλο και εντοπίζεται εξ’ ολοκλήρου στο κυτταρόπλασμα. Για να διαλευκανθεί ο ρόλος της RNase ZS αλλά και για να μελετηθεί περαιτέρω η RNase ZL, αρχικά, κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες στέρησης θρεπτικών στοιχείων, καθώς και παρουσία Η2Ο2 ώστε να προσδιοριστούν συγκεκριμένα πρότυπα συνέκφρασης. Παρατηρήθηκε ταυτόχρονη αύξηση των ELAC1-ANG γεγονός που αναδεικνύει τον ρόλο αυτών των πρωτεϊνών σε αποκρίσεις στο στρες αλλά και στη δημιουργία θραυσμάτων tRNAs. Στη συνέχεια υπερεκφράστηκαν τα γονίδια ELAC1 και ELAC2 σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 με σκοπό τη μελέτη των επιπέδων έκφρασης σημαντικών γονιδίων τα προϊόντα των οποίων συμμετέχουν στην ωρίμανση αλλά και στη θραύση tRNAs, στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, στο μηχανισμό RNAi και παράλληλα μελετήθηκαν και τα επίπεδα έκφρασης σημαντικών lncRNAs. Επιπλέον έγινε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου μετά από την υπερέκφραση για να δούμε πως επηρεάζεται από τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Το πρότυπο έκφρασης για αυτά τα γονίδια, ύστερα από υπερέκφραση του ELAC1 αναδεικνύει τον προστατευτικό ρόλο που ενδέχεται να έχει η RNase ZS καθώς μειορυθμίζονται lncRNAs που ευνοούν τη μετάσταση και την επαναφορά σε μία βλαστική κατάσταση. Παράλληλα τα επίπεδα έκφρασης των AGO1 και AGO2 ήταν μειωμένα σε σημαντικό βαθμό και πιθανότατα να επηρεάζεται πληθώρα mRNAs που στοχεύονται από σύμπλοκα RISC (RNA-induced silencing complex) τα οποία περιέχουν μία από αυτές τις AGO πρωτεΐνες. Υπερεκφράζοντας το γονίδιο ELAC2 παρατηρήθηκε ένα πρότυπο έκφρασης από όλα τα γονίδια που μελετήθηκαν το οποίο υποδηλώνει ότι η RNase ZL ευνοεί το πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση. Επιπλέον, αλλάζοντας την αναλογία των επιπέδων έκφρασης των AGO γονιδίων πιθανότατα επάγει περαιτέρω πλειοτροπικές αλλαγές στα κύτταρα. Τέλος, στη παρούσα διπλωματική εργασία δημιουργήθηκε μία κυτταρική σειρά HEK-293T στην οποία απαλείφθηκε το γονίδιο ELAC1 με την χρήση της τεχνικής γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR-Cas9 και πιστοποιήθηκε η έλλειψη μιας σημαντικής ριβονουκλεάσης. Η απουσία της πρωτεΐνης δεν φαίνεται να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων αλλά επίσης ούτε τη μορφολογία και την κατανομή των κυττάρων στις διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου.
|
|---|
