Νανοσωματίδια χρυσού για την στοχευμένη χορήγηση πακλιταξέλης σε καρκινικούς όγκους

• Κύριος συγγραφέας: Αρβανίτη, Αγγελική
• Άλλοι συγγραφείς: Αυγουστάκης, Κωνσταντίνος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2019
• Θέματα: Ελεγχόμενη αποδέσμευση φαρμάκων; Νανοσωματίδια χρυσού; Φυλλικό οξύ; Πακλιταξέλη; Καρκίνος; Controlled drug delivery systems; Gold nanoparticles; Folic acid; Paclitaxel; Cancer; 615.19

Η πακλιταξέλη (PTX), μέλος της οικογένειας των ταξανίων, είναι ένας από τους πιο χρήσιμους και αποτελεσματικούς αντινεοπλασματικούς παράγοντες για τη θεραπεία πολλών μορφών προχωρημένων και ανθεκτικών καρκίνων. Η επιτυχία της PTX σε αυτές τις ασθένειες οφείλεται στις μοναδικές ιδιότητές της όπως ευρύ φάσμα αντικαρκινικής δράσης, αποτελεσματικότητα τόσο στους συμπαγείς όσο και στους μεταστατικούς όγκους και ιδιαίτερο μηχανισμό δράσης. Αυτό το φάρμακο έχει παίξει κρίσιμο ρόλο στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών και του μαστού, ακόμη και ως μεμονωμένος παράγοντας ενώ παράλληλα έχει σημειώσει σημαντική πρόοδο στη θεραπεία ασθενών με μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Ωστόσο, οι σημαντικές παρενέργειες που παρουσιάζονται από το συμβατικό τρόπο χορήγησης της πακλιταξέλης έχουν οδηγήσει στην εισαγωγή της σε Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης (DDS). Τα συγκεκριμένα συστήματα επιτρέπουν την εκλεκτική μεταφορά του φαρμάκου στον καρκινικό ιστό με μηχανισμούς παθητικής ή ενεργητικής στόχευσης, καθώς και τον έλεγχο του φαρμακοκινητικού προφίλ. Πρόσφατα, έχουν αναπτυχθεί εναλλακτικές μορφές χορήγησής της μέσω νανοδομών, ικανές να ξεπεράσουν αυτούς τους περιορισμούς. Ιδιαίτερα ελπιδοφόρα φαίνεται να είναι η ενσωμάτωση της PTX σε νανοσωματίδια χρυσού. Τα νανοσωματίδια χρυσού διαθέτουν εύκολα ελεγχόμενη επιφανειακή χημεία επιτρέποντας τη τροποποίησή τους, προκειμένου να καταστούν λειτουργικά, με διάφορα βιολογικά μόρια για την αποφυγή ανίχνευσης από το ανοσοποιητικό σύστημα, τη βελτίωση της σταθερότητας τους, τη στόχευση όγκων και τη διέλευση βιοφυσικών φραγμών. Η δυνατότητα τροποποίησης της επιφάνειας των νανοσωματιδίων χρυσού παρέχει τη δυνατότητα εγκλωβισμού σε αυτά πολλαπλών θεραπευτικών παραγόντων ή βιομακρομορίων μέσω ομοιοπολικής ή μη σύνδεσης στην επιφάνειά τους. Παράλληλα μπορεί να επιτευχθεί ειδική κυτταρική σύνδεση όταν μόρια ενεργούς στόχευσης, όπως το φυλλικό οξύ, συνδεθούν στην επιφάνεια των νανοφορέων. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκε φόρτωση της πακλιταξέλης σε νανοσωματιδία χρυσού σταθεροποιημένα με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ και τροποποιημένα με φυλλικό οξύ (AuNP MOA FA), με σκοπό την αποδέσμευση του φαρμάκου εκλεκτικά σε καρκινικούς όγκους που υπερεκφράζουν υποδοχείς φυλλικού οξέος. Η παρασκευή υδατοδιαλυτών νανοσωματιδίων χρυσού που προστατεύονται από μονοστοιβάδες (AuNP-MOA) πραγματοποιήθηκε με αναγωγή του HAuCl4 από ισχυρό αναγωγικό παράγοντα (βοροϋδρίδιο του νατρίου, NaBH4) παρουσία μορίων με ομάδες θειόλης (μερκαπταοκτανοϊκό οξύ, ΜΟΑ), γνωστή και ως Brust-Schiffrin μέθοδος. Η επιλογή του διλειτουργικού συνδέτη (μερκαπτοοκτανοϊκό οξύ, ΜΟΑ), ως προστατευτικού παράγοντα, παρέχει αρκετά πλεονεκτήματα. Η ομάδα θειόλης δρα ως παράγοντας σταθεροποίησης του πυρήνα του χρυσού λόγω του ισχυρού χημικού δεσμού που σχηματίζεται μεταξύ του χρυσού και του θείου (S-Au), ενώ οι καρβοξυλικές ομάδες μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως πεδίο σύζευξης με μόρια στόχευσης μέσω δεσμών εστέρα ή αμιδίου, Στη συνέχεια διεξήχθη σύνδεση με μόριο βιολογικού σηματοδότη (φυλλικό οξύ, FA) που αποτελεί έναν ευρέως χρησιμοποιούμενο υδρόφιλο συνδέτη για στόχευση του υποδοχέα φυλλικού οξέος των καρκινικών κυττάρων. Ειδικότερα η βιο-στόχευση επιτεύχθηκε με σύζευξη των καρβοξυλομάδων της τελικής αλυσίδας των νανοσωματιδίων χρυσού με το φυλλικό οξύ, ενισχύοντας την υδροφιλικότητα των νανοσωματιδίων και να προσδίδοντας τους ικανότητα επιλεκτικής στόχευση όγκων. Πιο συγκεκριμένα έγινε σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού με τη μέθοδο Brust-Schiffrin των οποίων η επιφάνεια στη συνέχεια τροποποιήθηκε με φυλλικό οξύ. Η σύνδεση των υποκαταστατών στα νανοσωματίδια χρυσού επιβεβαιώθηκε ποιοτικά και προσδιορίστηκε ποσοτικά με φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό. Επιπλέον, εξετάστηκε η σταθερότητα των διασπορών πριν και μετά τη σύνδεση του φυλλικού οξέος παρουσία ηλεκτρολυτών (NaCl) με μέτρηση της υδροδυναμικής διαμέτρου και του επιφανειακού φορτίου, χρησιμοποιώντας την τεχνική της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Ακολούθησε μορφολογική εκτίμηση των διασπορών με τη βοήθεια ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διάδοσης (ΤΕΜ). Σε επόμενο στάδιο, μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά το ποσοστό φόρτωσης της ΡΤΧ στα τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού και πραγματοποιήθηκε μελέτη αποδέσμευσης σε διάλυμα φωσφορικών αλάτων (pH =7.4) στους 37 °C για 48 h. Τέλος, εξετάστηκε η κυτταροτοξικότητα των «φορτωμένων» (με ΡΤΧ) νανοσωματιδίων χρυσού και συγκρίθηκε με εκείνη των «κενών» νανοφορέων, αλλά και του φαρμάκου. Ο έλεγχος αυτός πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ στις καρκινικές σειρές MDA-MB 231 και MCF-7, από τις οποίες η πρώτη εκφράζει υποδοχείς φυλλικού οξέος ενώ η δεύτερη όχι. Τα σταθεροποιημένα με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματίδια χρυσού (AuNP MOA) είχαν με βάση το ΤΕΜ εύρος μεγέθους 4,76-14,82 nm και με βάση τις μελέτες αντίστασης στην επαγόμενη από ηλεκτρολύτη συσσωμάτωση δεν εμφάνισαν επαρκή κολλοειδή σταθερότητα. Τα τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού (ΑuNP MOA FA) είχαν με βάση το ΤΕΜ εύρος μεγέθους 5,02–18,23 nm και εμφάνισαν υψηλή κολλοειδή σταθερότητα παρουσία ηλεκτρολυτών. Η ικανότητα φόρτωσης πακλιταξέλης στα νανοσωματίδια χρυσού (AuNP MOA FA) ήταν 5,49%±0,13 w/w για θεωρητική φόρτωση 9,09% και μπορεί να θεωρηθεί ικανοποιητική. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς παρουσίασαν παρατεταμένη αποδέσμευση (Controlled Drug Release) του φαρμάκου σε συνθήκες που προσομοιάζουν τις βιολογικές (pH = 7.4) με μία απελευθέρωση της τάξης 80% σε 48 ώρες. Τα νανοσωματίδια χρυσού χωρίς πακλιταξέλη (blank ΑuNPs) δεν παρουσίασαν κυτταροτοξικότητα και στις δύο καρκινικές σειρές, μόνο στις μεγάλες συγκεντρώσεις εμφάνισαν μικρή τοξικότητα στα MCF7. Τα «φορτωμένα» με φάρμακο νανοσωματίδια χρυσού προκάλεσαν μεγαλύτερη τοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα και από το ελεύθερο φάρμακο, ιδιαίτερα στις υψηλές συγκεντρώσεις του φαρμάκου. Τα παραπάνω αποτελέσματα δικαιολογούν την περαιτέρω διερεύνηση της πιθανής χρησιμοποίησης των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (ΑuNP MOA FA) ως φορείς στοχευμένης χορήγησης της Πακλιταξέλης.