Επίδραση της β-τρυπτάσης στη παραγωγή συστατικών του εξωκυττάριου χώρου από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα ανθρώπου

• Κύριος συγγραφέας: Βοεράκος, Ιωάννης
• Άλλοι συγγραφείς: Αλετράς, Αλέξιος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2019
• Θέματα: Ρινικός πολύποδας; Τρυπτάση; Ινοβλάστες; Εξωκυττάριος χώρος; Nasal polyps; Tryptase; Fibroblasts; Extracellular matrix; 616.210 71

Ο ρινικός πολύποδας είναι μια χρόνια φλεγμονώδης πάθηση του ρινικού βλεννογόνου, που χαρακτηρίζεται από διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων, κυρίως ηωσινόφιλων, τροποποιήσεις στην διαφοροποίηση του επιθηλίου, αναδιαμόρφωση του ιστού, που περιλαμβάνει υπερπλασία της βασικής μεμβράνης, συσσώρευση εξωκυττάριου υλικού και οίδημα, με αποτέλεσμα την δημιουργία χαρακτηριστικών μορφομάτων που αποφράζουν τις ανώτερες αναπνευστικές οδούς. Αν και η παθογένεια της νόσου δεν έχει ακόμα αποσαφηνιστεί, η πυροδότησή της πιθανώς οφείλεται στον τραυματισμό που υφίσταται το επιθήλιο λόγω αλλεργιών ή άλλων άγνωστων παραγόντων, καθώς και ιογενών λοιμώξεων. Όπως και σε διάφορες άλλες ασθένειες και φλεγμονώδεις αντιδράσεις, έτσι και στον ρινικό πολύποδα, παρατηρούνται διαδικασίες του ιστού που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό τον ινοβλαστών. Σε αυτές τις περιπτώσεις, κοινά χαρακτηριστικά είναι ο αυξημένος αριθμός των ινοβλαστών/μυοϊνοβλαστών και η εναπόθεση συστατικών του εξωκυττάριου χώρου. Ακόμα, συνήθης είναι η παρουσία των σιτευτικών κυττάρων, τα οποία φαίνεται να κατέχουν σημαντικό ρόλο στην ίνωση, καθώς μπορούν να απελευθερώσουν πληθώρα μεσολαβητών που ενδεχομένως εμπλέκεται στην διαδικασία αυτή. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει ένα από τα προϊόντα των σιτευτικών κυττάρων, η σερινοπρωτεάση τρυπτάση, η οποία παρουσιάζει μιτογόνο δράση στους ινοβλάστες, κυρίως μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα ενεργοποιούμενου από πρωτεάσες-2 (PAR-2). Έχει αναφερθεί ότι η τρυπτάση επάγει τον πολλαπλασιασμό ινοβλαστών πνεύμονα, νεφρού και επιπεφυκότα οφθαλμού, καθώς και την έκφραση του κολλαγόνου τύπου I, της ινονεκτίνης και της κυκλοοξυγονάσης-2 (COX-2) από τα ίδια κύτταρα. Στην παρούσα εργασία, διερευνάται η παρουσία σιτευτικών κυττάρων, που παράγουν τρυπτάση, σε ιστούς ρινικού πολύποδα, καθώς και η επίδραση που έχει η ανθρώπινη τρυπτάση στον πολλαπλασιασμό καλλιεργημένων ινοβλαστών ρινικού πολύποδα, και στην έκφραση διάφορων παραγόντων από αυτούς, οι οποίοι εμπλέκονται στην παθογένεια της νόσου. Συλλέχθηκαν ρινικοί πολύποδες από ασθενείς που υπέφεραν από χρόνια ρινίτιδα με πολυποδίαση, μετά από ενδοσκοπική χειρουργική επέμβαση, και φυσιολογικοί ρινικοί βλεννογόνοι από υγιή άτομα, που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου, έπειτα από χειρουργική επέμβαση του διαφράγματος. Ινοβλάστες ρινικού πολύποδα παρελήφθησαν ύστερα από καλλιέργεια μικρών τεμαχίων του ιστού σε πλαστικές φιάλες σε μέσο καλλιέργεια DMEM και μετανάστευση των ινοβλαστών από τα τεμάχια του ιστού. Η παρουσία των σιτευτικών κυττάρων στους ιστούς ρινικού πολύποδα επιβεβαιώθηκε με ιστοχημική χρώση με την μέθοδο Giemsa/κυανούν της τολουιδίνης, και ο εντοπισμός της τρυπτάσης στα κύτταρα αυτά, με ανοσοϊστοχημική χρώση με τη μέθοδο του συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (ABC), χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα έναντι της ανθρώπινης τρυπτάσης. Τα επίπεδα της IL-6, της IL-8 και του TIMP-1 στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων προσδιορίστηκαν με ELISA, ενώ τα επίπεδα της MMP-2 με ζυμογράφημα ζελατίνης. Η έκφραση των COX-1, COX-2, ICAM-1, PAR-2, κολλαγόνο τύπου I, TIMP-1 και της ινονεκτίνης από καλλιεργημένους ινοβλάστες ρινικού πολύποδα ή από ιστούς ρινικού πολύποδα διαπιστώθηκε με ημι-ποσοτική PCR ή PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR). Τέλος, η μελέτη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο MTT, ενώ η δραστικότητα τρυπτάσης εξετάστηκε χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα BARNA. Μέσω ιστοχημικής χρώσης διαπιστώθηκε η παρουσία σιτευτικών κυττάρων στο καλυπτήριο επιθήλιο και στο στρώμα ρινικού πολύποδα. Πραγματοποιήθηκε περαιτέρω επιβεβαίωση μέσω ανοσοϊστοχημείας, χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα έναντι της ανθρώπινης τρυπτάσης, και παρατηρήθηκε ότι τόσο στο καλυπτήριο επιθήλιο όσο και στο στρώμα ιστών ρινικού πολύποδα απαντώνται σιτευτικά κύτταρα που παράγουν τρυπτάση. Χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα BARNA, ανιχνεύτηκε ενζυμική δραστικότητα στο μέσο καλλιέργειας ιστών ρινικού πολύποδα, η οποία κατεστάλη σημαντικά από το αναστολέα της τρυπτάσης APC 366, υποδεικνύοντας την παρουσία ενεργής τρυπτάσης στο μέσο καλλιέργειας, ως αποτέλεσμα της αποκοκκίωσης των σιτευτικών κυττάρων στον ιστό του ρινικού πολύποδα. Με RT-PCR ανάλυση δείχθηκε ότι η έκφραση της COX-1, της COX-2 και του PAR-2 ήταν αυξημένη στον πολύποδα σε σχέση με τον φυσιολογικό ρινικό βλεννογόνο, υποδηλώνοντας ότι αυτοί οι παράγοντες μάλλον εμπλέκονται στην παθογένεια του ρινικού πολύποδα. Επίσης μέσω RT-PCR, αποδείχθηκε ότι οι ινοβλάστες ρινικού πολύποδα εκφράζουν τον PAR-2, μέσω του οποίου ασκείται η μιτογόνος δράση της τρυπτάσης στα κύτταρα αυτά, όπως επιβεβαιώθηκε με την χρήση του ανταγωνιστή του PAR-2, GB-83. Επίσης, καλλιέργεια ινοβλαστών ρινικού πολύποδα που πραγματοποιήθηκε παρουσία τρυπτάσης, έδειξε ότι η τρυπτάση επάγει την έκφραση των COX-1, COX-2, κολλαγόνου τύπου I, ινονεκτίνης και ICAM-1, μέσω ενεργοποίησης του PAR-2, το οποίο επιβεβαιώθηκε επίσης με την χρήση του GB-83. Ακόμα, η τρυπτάση δείχθηκε ότι επάγει την παραγωγή της MMP-2, ενώ καταστέλλει την παραγωγή του TIMP-1. Ωστόσο, δεν παρουσίασε καμία επίδραση στην παραγωγή IL-6 και IL-8 από τους ινοβλάστες ρινικού πολύποδα. Με την χρήση αναστολέων των MAP κινασών, βρέθηκε ότι οι MEK1/2, JNKs και p38 κινάσες εμπλέκονται στην έκφραση του κολλαγόνου τύπου I, του ICAM-1 και της ινονεκτίνης, ενώ μόνο οι MEK1/2 και οι JNKs εμπλέκονται στην έκφραση της COX-1. Τα σιτευτικά κύτταρα φαίνεται ότι προσελκύονται στον φλεγμένοντα ρινικό βλεννογόνο όπου και απελευθερώνουν τρυπτάση, η οποία με την σειρά της διεγείρει την παραγωγή παραγόντων που συνεισφέρουν στην συσσώρευση εξωκυττάριου υλικού και την ίνωση, από ινοβλάστες του στρώματος, με αποτέλεσμα τη δημιουργία και ανάπτυξη του ρινικού πολύποδα.