Έκφραση και καθορισμός του συμπλόκου Cdt1 και Geminin σε βακτηριακά κύτταρα

• Κύριος συγγραφέας: Καραντζέλης, Νικόλαος
• Άλλοι συγγραφείς: Ταραβήρας, Σταύρος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2008
• Θέματα: Πρωτεϊνική αλληλεπίδραση; Πρωτεϊνικός καθαρισμός; Geminin; Cdt1; Protein-protein interaction; FRET; Protein purification; 660.63

Η ακρίβεια και η πιστότητα της διαδικασίας διπλασιασμού του γονιδιώματος είναι μείζωνος σημασίας για την κυτταρική επιβίωση. Τυχόν ανωμαλίες όπως μεταλλάξεις ή χρωμοσωμικές ανωμαλίες είναι δυνατόν να οδηγήσουν στην εμφάνιση κακοήθειας ή σε πρόωρο κυτταρικό θάνατο. Τα παραπάνω συνηγορούν στη μεγάλη σημασία που έχει η άρτια λειτουργία και ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Δύο πρωτεϊνες, οι geminin και cdt1, κατέχουν πολύ σημαντικό ρόλο κατά τη διαδικασία ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου. Πιο συγκεκριμένα, η cdt1 αποτελεί έναν βασικό παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής. Δρα συνεργατικά με την πρωτεϊνη Cdc6 προκειμένου να γίνει η πρόσδεση του εξαμερούς συμπλόκου MCM2-7 στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (pre-RC), διασφαλίζοντας με τον τρόπο αυτό τις απαραίτητες συνθήκες για τη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής (Maiorano D. et al., 2000). Η geminin συνιστά τον φυσικό αναστολέα της cdt1 στα μετάζωα. Προσδένεται ισχυρά στην τελευταία μετά την έναρξη της σύνθεσης του DNA, παρεμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο την επαναπρόσδεσή της στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (Tada S. et al., 2001; Wohlschlegel J.A. et al., 2000). Η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής παρουσιάζει ανωμαλίες σε περιπτώσεις καρκινικών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, έχει δειχθεί σταθερή υπερέκφραση της cdt1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, τόσο σε πρωτεϊνικό όσο και σε μεταγραφικό επίπεδο (Xouri G. et al., 2004). Παρομοίως, αυξημένη έκφραση της cdt1 έχει παρατηρηθεί και σε περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου καθώς και πρώιμου καρκίνου του πνεύμονα, στον άνθρωπο (Bravou V. et al., 2005; Karakaidos P. et al., 2004). Τα παραπάνω αποτελέσματα έχουν προκύψει κατόπιν μελέτης, η οποία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριό μας. Αναφορικά με τη geminin, αυξημένα επίπεδα έκφρασής της έχουν συσχετιστεί με καρκινώματα παχέος εντέρου καθώς και με τη διαίρεση κακοηθών κυττάρων, γενικότερα (Gonzalez M.A. et al., 2005; Wohlschlegel J.A. et al., 2002). Επιπροσθέτως, η geminin βρίσκει εφαρμογή ως ανεξάρτητος δείκτης σε περιπτώσεις επιθετικού καρκίνου του μαστού (Gonzalez M.A. et al., 2004). Βασιζόμενοι στα παραπάνω, θεωρούμε ότι το σύμπλοκο geminin-cdt1 συνιστά έναν ιδανικό στόχο για το σχεδιασμό νέων αντικαρκινικών φαρμάκων. Το πρώτο βήμα προς αυτήν την κατεύθυνση αποτελεί ο μαζικός έλεγχος συνθετικών συστατικών, τα οποία να έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου. Ενδεχόμενη εύρεση τέτοιων συνθετικών συστατικών καθώς και μετέπειτα φυσικοχημική βελτιστοποίησή τους είναι δυνατόν να οδηγήσει στη δημιουργία ενός νέου αντικαρκινικού φαρμάκου. Η ολοκλήρωση της χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος συνέβαλε στην ταυτοποίηση νέων πρωτεϊνικών μορίων στόχων, τα οποία εμπλέκονται στο μοριακό μηχανισμό διαφόρων ασθενειών. Με βάση τις εξελίξεις των τελευταίων χρόνων στον τομέα της φαρμακοβιομηχανίας, η αξιοποίηση αυτής της γνώσης συνδέεται με το μαζικό έλεγχο συνθετικών συστατικών έναντι αυτών των μορίων στόχων. Απώτερο στόχο αποτελεί η αναγνώριση κατάλληλων συνθετικών συστατικών τα οποία θα έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με το μόριο-στόχος και κατ’επέκταση να μεταβάλλουν τον τρόπο λειτουργίας του, προκειμένου να έχουμε το επιθυμητό φαρμακολογικό αποτέλεσμα. Αποφασιστικής σημασίας στην παραπάνω διαδικασία, αποτελεί η σωστή επιλογή της κατάλληλης μεθόδου μαζικού ελέγχου των νέων υποψήφιων φαρμάκων – συνθετικών συστατικών – έναντι του μορίου στόχου. Στην παρούσα διπλωματική, επιλέχθηκε προς εφαρμογή η μέθοδος FRET. Ένα από τα βασικά της πλεονεκτήματα είναι η υψηλή αναλογία ‘σήματος-θορύβου’ που εμφανίζει καθώς και η υψηλή ποιότητα των δεδομένων που παρέχει. Αν και αποτελεί μία σχετικά καινούρια τεχνική, εντούτοις αποτελεί μία από τις πιο βασικές μεθόδους της σύγχρονης φαρμακοβιομηχανίας λόγω της αξιοπιστίας που την χαρακτηρίζει και επιπλέον της συμβατότητάς της με αυτοματοποιημένες τεχνικές. Ασφαλώς, απαραίτητη προϋπόθεση για την εφαρμογή της συγκεκριμένης μεθόδου αποτελεί η απομόνωση της υπό μελέτη πρωτεϊνης. Η έκφραση του πρωτεϊνικού συμπλόκου geminin-cdt1 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση βακτηριακών συστημάτων έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών. Επίσης, ο καθαρισμός του συμπλόκου υπήρξε επιτυχής και βασίστηκε στην εφαρμογή των τεχνικών της χρωματογραφίας συγγένειας και της χρωματογραφίας διήθησης σε πηκτή. Το επόμενο βήμα ήταν να διαπιστώσουμε εάν η μέθοδος FRET καθιστά δυνατή την ανίχνευση σχηματισμού του συμπλόκου. Πράγματι, κάτι τέτοιο ήταν εφικτό καθώς σε συγκέντρωση 60-80nM του συμπλόκου, παρατηρήθηκε αύξηση του σήματος σχεδόν κατά πέντε φορές υψηλότερα από το επίπεδο “θορύβου”. Το αποτέλεσμα αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό καθώς συνεπάγεται ότι με τη συγκεκριμένη μέθοδο είναι εφικτός ο μαζικός έλεγχος συνθετικών συστατικών, τα οποία θα έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου. Οι λόγοι που συντελούν στην καταλληλότητα της μεθόδου για αυτό το σκοπό έγκεινται αφενός στην ευαισθησία την οποία εμφανίζει (αύξηση του σήματος μέχρι και πέντε φορές) και αφετέρου στην ειδικότητα και την αξιοπιστία της, όπως έχει δειχθεί και με τα αντίστοιχα πειράματα. Σημαντικό επίσης πλεονέκτημα αποτελεί και η μικρή σχετικά ποσότητα πρωτεϊνης (60-80nM), η οποία απαιτείται. Σύμφωνα με τα δεδομένα που έχουν προκύψει από την παρούσα διπλωματική , το FRET assay συνιστά μία ιδανική μέθοδο για την πραγματοποίηση μαζικού ελέγχου συνθετικών συστατικών, τα οποία θα έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου geminin-cdt1. Δεδομένης της πολύ ισχυρής αλληλεπίδρασης του συγκεκριμένου συμπλόκου, πραγματοποιήθηκαν μεταλλαγές σε τρία υψηλά συντηρημένα κατάλοιπα της cdt1, τα οποία κατέχουν κυρίαρχο ρόλο στην αλληλεπίδραση με τη geminin, σύμφωνα με κρυσταλλογραφικά δεδομένα (Lee C. et al., 2004). Οι μεταλλαγές αυτές ενδέχεται να συμβάλλουν σε ένα πολύ πιο εύκολα διασπάσιμο σύμπλοκο, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στην ευκολότερη και γρηγορότερη ταυτοποίηση υποψήφιων συνθετικών συστατικών.