Δομικές και λειτουργικές αλλαγές της πρωτεϊνοσυνθετικής μηχανής στο μύδι Mytilus Galloprovincialis μετά από πειραματική έκθεση σε τοξικά μέταλλα

• Main Author: Κουρνούτου, Γεωργία
• Other Authors: Καλπαξής, Δημήτριος
• Format: Thesis
• Language: Greek
• Published: 2019
• Subjects: Χαλκός; Υδράργυρος; Κάδμιο; Οξειδωτικό στρες; Ριβοσωματικές πρωτεΐνες; Πρωτεϊνοσύνθεση; Copper; Μercury; Cadmium; Oxidative stress; Ribosomal proteins; Protein synthesis; 571.951 44

Τα παράκτια υδάτινα οικοσυστήματα αποτελούν ένα δυναμικό περιβάλλον, το οποίο επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων η ποιότητα του νερού και η ανθρώπινη δραστηριότητα. Ανάμεσα στις χημικές ουσίες που απαντώνται στα θαλάσσια ύδατα και αποτελούν αντικείμενο των οικοτοξικολογικών μελετών λόγω των πιθανών επιπτώσεών τους στο περιβάλλον και τη δημόσια υγεία, ανήκουν τα τοξικά μέταλλα καθώς και τα απαραίτητα μέταλλα, τα οποία όμως γίνονται τοξικά όταν ο συγκεντρώσεις τους υπερβούν κάποια όρια. Ανάμεσα στις προαναφερθείσες κατηγορίες ανήκουν ο Cu (Cu), ο Hg (Hg) και το Cd (Cd), τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως ρύποι στην παρούσα διατριβή σε συγκεντρώσεις 40 μg/L, 30 μg/L και 100 μg/L, αντίστοιχα για περίοδο έκθεσης που κυμάνθηκε από 5 ημέρες, όπου το οξειδωτικό στρες θεωρείται οξύ ή υποχρόνιο, (acute or sub-chronic), έως 15 ημέρες όπου χαρακτηρίζεται ως χρόνιο (chronic). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μια άμεση ανταπόκριση των πεπτικών κυττάρων μυδιών Mytilus galloprovincialis εκτεθειμένων σε μέταλλα, είναι η αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Όμως, ορισμένα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες διευκολύνουσες την προσαρμογή των κυττάρων στο στρες από μέταλλα, μεταφράζονται αποδοτικά. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει τη συσχέτιση μεταξύ του προκαλούμενου οξειδωτικού στρες και της επαγόμενης πτώσης της πρωτεϊνοσύνθεσης, με τις δομικές αλλοιώσεις, τις οποίες υφίστανται τα συστατικά της πρωτεΐνοσυνθετικής μηχανής. Κατ΄ αρχάς έγινε εκτίμηση ορισμένων κλασικών δεικτών καταπόνησης υπό την επίδραση των τριών μετάλλων, όπως μέτρηση συχνότητας μικροπυρήνων, χρόνου αποσταθεροποίησης λυσσοσωματικής μεμβράνης, υπεροξείδωσης λιπιδίων, παραγόμενου σουπεροξειδίου και εκτίμηση οξειδωτικής βλάβης στο DNA και το RNA μέσω προσδιορισμού της 8-ΟΗdG και 8-OHG. Ακόμη, μελετήθηκαν τα επίπεδα αντιοξειδωτικών μορίων που περιλαμβάνουν τη σουπεροξειδική δισμουτάση, τη γλουταθειόνη και τις μεταλλοθειονίνες. Κατόπιν της εκτίμησης του οξειδωτικού προφίλ των μυδιών, η μελέτη επικεντρώθηκε στη διερεύνηση των αλλοιώσεων που προκαλούνται στο ριβοσωματικό RNA, μετά από έκθεση σε μέταλλα. Η ανάλυση που έγινε στα μόρια 5S και 18S, έδειξε την παρουσία θραύσεων και τροποποιήσεων σε περιοχές των μορίων οι οποίες σχηματίζουν λειτουργικά κέντρα του ριβοσώματος, όπως το κέντρο αποκωδικοποίησης. Η έκθεση σε χαλκό και υδράργυρο προκάλεσε παρόμοια αποτελέσματα με τη μέγιστη βλάβη να παρατηρείται στις 15 ημέρες έκθεσης, ενώ αντίθετα οι μεγαλύτερες αλλοιώσεις στην περίπτωση του καδμίου προκλήθηκαν στις 5 ημέρες, με το φαινόμενο να αντιστρέφεται σε χρόνια έκθεση, λόγω της επαγωγής αντιοξειδωτικών μηχανισμών, όπως η δράση μεταλλοθειονινών και της γλουταθειόνης. Οι διαταραχές που παρατηρήθηκαν δείχνουν την ίδια τάση με αυτήν της πρωτεΐνοσυνθετικής ικανότητας των μυδιών, δείχνοντας έτσι ότι οι δομικές αλλαγές του ριβοσώματος αποτελούν τη βάση για τις μεταφραστικές αποκρίσεις στο στρες. Κατόπιν, η μελέτη επικεντρώθηκε στις ριβοσωματικές πρωτεΐνες και τους μεταφραστικούς παράγοντες. Οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες είναι το κύριο προϊόν της οξείδωσης των πρωτεϊνών και χρησιμοποιούνται ευρέως ως δείκτες οξειδωτικού στρες. H μέτρησή τους βασίζεται στην ιδιότητα των κετονών ή αλδεϋδών να αντιδρούν με 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνη (DNPH) ως εκ τούτου με τη χρήση anti-DNP αντισώματος μπορούν να προσδιοριστούν και να ποσοτικοποιηθούν οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες στα κυτταρικά εκχυλίσματα. Όσον αφορά τους μεταφραστικούς παράγοντες σε δείγματα μυδιών κατεργασμένων με Cu ή Hg, παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη αύξηση του βαθμού καρβονυλίωσης κατά χρονο-εξαρτώμενο τρόπο. Aντίθετα, το Cd προκάλεσε αρχικά αύξηση στα επίπεδα καρβονυλίωσης, που στη συνέχεια υποχώρησε. Το ίδιο παρατηρήθηκε όταν αναλύθηκαν ολικές ή ριβοσωματικές πρωτεΐνες, με τη σημείωση ότι η καρβονυλίωση ήταν ηπιότερη στις τελευταίες. Όμως δεδομένου ότι εκτός από την οξειδωτική βλάβη, τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών μεταβάλλονται μετά από έκθεση σε μέταλλα, προσδιορίστηκαν επίσης και οι μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης των προαναφερθέντων. Όσον αφορά στους μεταφραστικούς παράγοντες, που εμπλέκονται στην έναρξη και επιμήκυνση της πρωτεϊνικής σύνθεσης, δεδομένου ότι ρυθμιστικοί μηχανισμοί παρεμβαίνουν συνήθως κατά τη διάρκεια αυτών των μεταφραστικών φάσεων, τα αποτελέσματα ήταν τα εξής. Υπό την επίδραση Cu και Hg, τα επίπεδα του φωσφορυλιωμένου παράγοντα έναρξης eIF2α, έδειξαν αύξηση, η οποία εντάθηκε περαιτέρω κατά τη 15η ημέρα δειγματοληψίας. Η ίδια τάση αλλαγών στη φωσφορυλίωση παρατηρήθηκε για τον παράγοντα επιμήκυνσης eEF2 σε μύδια εκτεθειμένα στα μέταλλα. Όμως, έκθεση σε Cd προκάλεσε αντίθετο αποτέλεσμα. Πρέπει να σημειωθεί, ότι τα συνολικά επίπεδα αμφοτέρων των παραγόντων παρέμεναν σταθερά σε όλη τη διάρκεια έκθεσης. Παρομοίως, η έκφραση του παράγοντα έναρξης eIF4E παρέμενε σταθερή κατά την έκθεση σε Cu ή Hg, όμως αυξάνονταν σημαντικά κατά τη 15η ημέρα έκθεσης σε Cd. Είναι ενδιαφέρον ότι οι eIF4E-δεσμευόμενες πρωτεΐνες (4E-BPs), οι οποίες αναστέλλουν την cap-εξαρτώμενη μετάφραση, βρέθηκαν περισσότερο φωσφορυλιωμένες στα πρώιμα, παρά στα παρατεταμένα στάδια έκθεσης σε Cu ή Hg. Έκθεση σε Cd προκάλεσε πάλι το αντίθετο φαινόμενο. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση του eIF2α και το δίκτυο σηματοδότησης mTOR καθορίζουν τις μεταφραστικές ανταποκρίσεις στο στρες από βαρέα μέταλλα. Τέλος, η έκθεση σε μέταλλα, προκάλεσε σημαντικές αλλαγές στο πρότυπο έκφρασης των ριβοσωματικών πρωτεϊνών. Όσον αφορά στα μύδια που εκτέθηκαν σε χαλκό και υδράργυρο, στο 70% των πρωτεϊνών παρατηρήθηκαν αυξομειώσεις της έκφρασης με το φαινόμενο να είναι χρονοεξαρτώμενο, δηλαδή εντονότερο στις 15 ημέρες έκθεσης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι μεταβολές σχετίζονται και με το μέταλλο έκθεσης, αφού παρατηρήθηκαν διαφοροποιήσεις ως προς την ταυτότητα των επηρεαζόμενων πρωτεϊνών. Όσον αφορά στα μύδια που εκτέθηκαν σε Cd, οι πιο έντονες αλλαγές παρατηρήθηκαν τις πρώτες ημέρες έκθεσης. Όμως μετά την πάροδο των 15 ημερών έκθεσης, τα επίπεδα έκφρασης, επανήλθαν σχεδόν στα αρχικά επίπεδα που παρατηρούνται στα μύδια αναφοράς. Σε όλες όμως τις περιπτώσεις, οι πρωτεΐνες των οποίων η έκφραση διαταράχθηκε, είναι σημαντικές τόσο για τη συγκρότηση του ριβοσώματος όσο και για την εύρυθμη λειτουργία του καθώς συμμετέχουν σε λειτουργικές θέσεις, όπως η Α-θέση και η Ρ-θέση της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας, γεγονός που συνδέεται με τις παρατηρούμενες αλλαγές της πρωτεΐνοσυνθετικής ικανότητας των οργανισμών μετά από έκθεση σε μέταλλα. Περαιτέρω ανάλυση της καρβονυλίωσης των ριβοσωματικών πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση δυο διαστάσεων και ανοσοχημική ποσοτικοποίηση έδειξε εξειδικευμένο πρότυπο καρβονυλίωσης για κάθε μέταλλο, το οποίο ενδεχομένως θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της ρύπανσης από μέταλλα. Τα αποτελέσματα των κλασικών βιοχημικών αναλύσεων επιβεβαιώθηκαν με MS φασματοσκοπία και οι οξειδωτικές βλάβες των πρωτεϊνών ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο αμινοξέων, αναδεικνύοντας έτσι την αξιοπιστία του ακολουθούμενου πειραματικού πρωτοκόλλου και ενισχύοντας τη σημασία της πρωτεομικής ανάλυσης σε τοξικολογικές μελέτες.