Μελέτη του ρόλου της γενομικής μεθυλίωσης στη βιολογική συμπεριφορά κυτταρικών σειρών καρκίνου in vitro και in vivo
Η επιγενετική μελετά τους μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων από το γονότυπο προκύπτει ο φαινότυπος, στα τρισεκατομμύρια διαφορετικά κύτταρα του σώματος των θηλαστικών. Οι μηχανισμοί με τους οποίους η αλληλουχία του DNA οργανώνεται και εκφράζεται μέσα στον κυτταρικό πυρήνα, υπόκεινται σε αυστηρό...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2019
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/12247 |
| id |
nemertes-10889-12247 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Καρκίνος Μεθυλίωση RNA-ελικάση p68/Ddx5 Μεθυλοτρανσφεράσες Dnmts Cancer Methylation RNA-helicase p68/Ddx5 Methyltransferases Dnmts 616.994 042 |
| spellingShingle |
Καρκίνος Μεθυλίωση RNA-ελικάση p68/Ddx5 Μεθυλοτρανσφεράσες Dnmts Cancer Methylation RNA-helicase p68/Ddx5 Methyltransferases Dnmts 616.994 042 Κατσικάνη, Κλειώ Μελέτη του ρόλου της γενομικής μεθυλίωσης στη βιολογική συμπεριφορά κυτταρικών σειρών καρκίνου in vitro και in vivo |
| description |
Η επιγενετική μελετά τους μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων από το γονότυπο προκύπτει ο φαινότυπος, στα τρισεκατομμύρια διαφορετικά κύτταρα του σώματος των θηλαστικών. Οι μηχανισμοί με τους οποίους η αλληλουχία του DNA οργανώνεται και εκφράζεται μέσα στον κυτταρικό πυρήνα, υπόκεινται σε αυστηρό έλεγχο και πολυεπίπεδη ρύθμιση. Υπάρχει μία πληθώρα χημικών τροποποιήσεων του ίδιου του γενωμικού DNA, που παίζει καίριο ρόλο κατά την ανάπτυξη των θηλαστικών και διαφοροποιείται ποιοτικά και ποσοτικά στον καρκίνο. Οι τροποποιήσεις αυτές αποτελούνται εν μέρει από μεθυλιώσεις κυτοσινών και ονομάζονται γενωμικά πρότυπα μεθυλίωσης. Τα ένζυμα που ευθύνονται για τη δημιουργία, διατήρηση και διαφοροποίηση των προτύπων αυτών είναι οι μεθυλοτρανσφεράσες (Dnmts). Η ελικάση του RNA p68, γνωστή και ως Ddx5, έχει ταυτοποιηθεί προηγουμένως ως άμεσα αλληλεπιδρούσα με τα μέλη της οικογένειας των Dnmts. Η Ddx5 είναι μια RNA-εξαρτώμενη ATPάση, μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών DEAD-box. Η δράση της οριοθετείται στην έναρξη της μεταγραφής ως συν-ενεργοποιητής υποδοχέων των στεροειδών και της TP53 (p53), προωθώντας πιθανά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή/και την κυτταρική επιβίωση.
Εδώ, διερευνήσαμε την έκφραση και τον υποκυτταρικό εντοπισμό της Ddx5 σε ανθρώπινους καρκίνους εντέρου και πνεύμονα, όπως επίσης και σε διαφορετικού τύπου και προέλευσης επαγόμενους όγκους σε ποντίκια. Επιπλέον, διερευνήσαμε τη δράση της p68/Ddx5 ως πιθανού καρκινικού υποκινητή. Με κατάλληλο έναντι της Ddx5 αντισώματος, έγινε χρήση των τεχνικών του ανοσοστυπώματος Western, της ανοσοϊστοχημείας και της ανοσοκυτταροχημείας. Τα επίπεδα έκφρασης της Ddx5 χειραγωγήθηκαν, με μοριακές τεχνικές, σε καρκινικά κύτταρα ποντικού MC38, ενώ παράλληλα έγινε υπερέκφραση της άγριου τύπου πρωτεΐνης και έκφραση μιας μεταλλαγμένης Ddx5 (Ddx5mut), η οποία δεν δρα ως ελικάση και πιθανώς λειτουργεί σαν κυρίαρχη αρνητική μετάλλαξη. Ο ρόλος της Ddx5 διερευνήθηκε επίσης σε μοντέλα καρκινικής ανάπτυξης στο ποντίκι σε in vivo πειράματα ενδοϋπεζωκοτικής ή υποδόριας έγχυσης συγγενικών καρκινικών κυττάρων, τροποποιημένων ως προς τα επίπεδα έκφρασης της Ddx5.
Η Ddx5 εντοπίζεται στον πυρήνα, ενώ η ένταση του σήματος δείχνει να αυξάνεται ανάλογα με το στάδιο κακοήθειας στους εντερικούς και πνευμονικούς ανθρώπινους καρκίνους. Η Ddx5 ανιχνεύεται σε δύο μορφές: μία βραδύτερη και μία ταχύτερα κινούμενη στα πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου, η οποία εικάζεται ότι ίσως αποτελεί πρωτεολυτικό προϊόν της πρώτης. Η αποσιώπηση της Ddx5 στα MC38 δεν είχε σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη υποδόριων όγκων ή στη δημιουργία κακοήθους υπεζωκοτικής συλλογής στα ποντίκια. Εντούτοις, η υπερ-έκφραση της αγρίου τύπου Ddx5, αλλά όχι και της μεταλλαγμένης, προσδίδει ενδεχομένως ένα αναπτυξιακό πλεονέκτημα στα MC38, κατά την ανάπτυξη υποδόριων όγκων, ενώ η υπερέκφραση της μεταλλαγμένης Ddx5 στα ίδια κύτταρα παρουσιάζει μία τάση μείωσης του όγκου της κακοήθους υπεζωκοτικής συλλογής. |
| author2 |
Σταθόπουλος, Γεώργιος |
| author_facet |
Σταθόπουλος, Γεώργιος Κατσικάνη, Κλειώ |
| format |
Thesis |
| author |
Κατσικάνη, Κλειώ |
| author_sort |
Κατσικάνη, Κλειώ |
| title |
Μελέτη του ρόλου της γενομικής μεθυλίωσης στη βιολογική συμπεριφορά κυτταρικών σειρών καρκίνου in vitro και in vivo |
| title_short |
Μελέτη του ρόλου της γενομικής μεθυλίωσης στη βιολογική συμπεριφορά κυτταρικών σειρών καρκίνου in vitro και in vivo |
| title_full |
Μελέτη του ρόλου της γενομικής μεθυλίωσης στη βιολογική συμπεριφορά κυτταρικών σειρών καρκίνου in vitro και in vivo |
| title_fullStr |
Μελέτη του ρόλου της γενομικής μεθυλίωσης στη βιολογική συμπεριφορά κυτταρικών σειρών καρκίνου in vitro και in vivo |
| title_full_unstemmed |
Μελέτη του ρόλου της γενομικής μεθυλίωσης στη βιολογική συμπεριφορά κυτταρικών σειρών καρκίνου in vitro και in vivo |
| title_sort |
μελέτη του ρόλου της γενομικής μεθυλίωσης στη βιολογική συμπεριφορά κυτταρικών σειρών καρκίνου in vitro και in vivo |
| publishDate |
2019 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/12247 |
| work_keys_str_mv |
AT katsikanēkleiō meletētouroloutēsgenomikēsmethyliōsēsstēbiologikēsymperiphorakyttarikōnseirōnkarkinouinvitrokaiinvivo AT katsikanēkleiō studyfortheeffectofgenomicmethylationonthebiologyandbehaviorofcancercelllinesinvitroandinvivo |
| _version_ |
1771297292546998272 |
| spelling |
nemertes-10889-122472022-09-05T20:53:31Z Μελέτη του ρόλου της γενομικής μεθυλίωσης στη βιολογική συμπεριφορά κυτταρικών σειρών καρκίνου in vitro και in vivo Study for the effect of genomic methylation on the biology and behavior of cancer cell lines in vitro and in vivo Κατσικάνη, Κλειώ Σταθόπουλος, Γεώργιος Ματσούκας, Ιωάννης Ταραβίρας, Σταύρος Katsikani, Kleio Καρκίνος Μεθυλίωση RNA-ελικάση p68/Ddx5 Μεθυλοτρανσφεράσες Dnmts Cancer Methylation RNA-helicase p68/Ddx5 Methyltransferases Dnmts 616.994 042 Η επιγενετική μελετά τους μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων από το γονότυπο προκύπτει ο φαινότυπος, στα τρισεκατομμύρια διαφορετικά κύτταρα του σώματος των θηλαστικών. Οι μηχανισμοί με τους οποίους η αλληλουχία του DNA οργανώνεται και εκφράζεται μέσα στον κυτταρικό πυρήνα, υπόκεινται σε αυστηρό έλεγχο και πολυεπίπεδη ρύθμιση. Υπάρχει μία πληθώρα χημικών τροποποιήσεων του ίδιου του γενωμικού DNA, που παίζει καίριο ρόλο κατά την ανάπτυξη των θηλαστικών και διαφοροποιείται ποιοτικά και ποσοτικά στον καρκίνο. Οι τροποποιήσεις αυτές αποτελούνται εν μέρει από μεθυλιώσεις κυτοσινών και ονομάζονται γενωμικά πρότυπα μεθυλίωσης. Τα ένζυμα που ευθύνονται για τη δημιουργία, διατήρηση και διαφοροποίηση των προτύπων αυτών είναι οι μεθυλοτρανσφεράσες (Dnmts). Η ελικάση του RNA p68, γνωστή και ως Ddx5, έχει ταυτοποιηθεί προηγουμένως ως άμεσα αλληλεπιδρούσα με τα μέλη της οικογένειας των Dnmts. Η Ddx5 είναι μια RNA-εξαρτώμενη ATPάση, μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών DEAD-box. Η δράση της οριοθετείται στην έναρξη της μεταγραφής ως συν-ενεργοποιητής υποδοχέων των στεροειδών και της TP53 (p53), προωθώντας πιθανά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή/και την κυτταρική επιβίωση. Εδώ, διερευνήσαμε την έκφραση και τον υποκυτταρικό εντοπισμό της Ddx5 σε ανθρώπινους καρκίνους εντέρου και πνεύμονα, όπως επίσης και σε διαφορετικού τύπου και προέλευσης επαγόμενους όγκους σε ποντίκια. Επιπλέον, διερευνήσαμε τη δράση της p68/Ddx5 ως πιθανού καρκινικού υποκινητή. Με κατάλληλο έναντι της Ddx5 αντισώματος, έγινε χρήση των τεχνικών του ανοσοστυπώματος Western, της ανοσοϊστοχημείας και της ανοσοκυτταροχημείας. Τα επίπεδα έκφρασης της Ddx5 χειραγωγήθηκαν, με μοριακές τεχνικές, σε καρκινικά κύτταρα ποντικού MC38, ενώ παράλληλα έγινε υπερέκφραση της άγριου τύπου πρωτεΐνης και έκφραση μιας μεταλλαγμένης Ddx5 (Ddx5mut), η οποία δεν δρα ως ελικάση και πιθανώς λειτουργεί σαν κυρίαρχη αρνητική μετάλλαξη. Ο ρόλος της Ddx5 διερευνήθηκε επίσης σε μοντέλα καρκινικής ανάπτυξης στο ποντίκι σε in vivo πειράματα ενδοϋπεζωκοτικής ή υποδόριας έγχυσης συγγενικών καρκινικών κυττάρων, τροποποιημένων ως προς τα επίπεδα έκφρασης της Ddx5. Η Ddx5 εντοπίζεται στον πυρήνα, ενώ η ένταση του σήματος δείχνει να αυξάνεται ανάλογα με το στάδιο κακοήθειας στους εντερικούς και πνευμονικούς ανθρώπινους καρκίνους. Η Ddx5 ανιχνεύεται σε δύο μορφές: μία βραδύτερη και μία ταχύτερα κινούμενη στα πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου, η οποία εικάζεται ότι ίσως αποτελεί πρωτεολυτικό προϊόν της πρώτης. Η αποσιώπηση της Ddx5 στα MC38 δεν είχε σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη υποδόριων όγκων ή στη δημιουργία κακοήθους υπεζωκοτικής συλλογής στα ποντίκια. Εντούτοις, η υπερ-έκφραση της αγρίου τύπου Ddx5, αλλά όχι και της μεταλλαγμένης, προσδίδει ενδεχομένως ένα αναπτυξιακό πλεονέκτημα στα MC38, κατά την ανάπτυξη υποδόριων όγκων, ενώ η υπερέκφραση της μεταλλαγμένης Ddx5 στα ίδια κύτταρα παρουσιάζει μία τάση μείωσης του όγκου της κακοήθους υπεζωκοτικής συλλογής. Epigenetics study the molecular mechanisms through which the phenotype is derived from the genotype, in the trillions of different cells in the body of mammals. The mechanisms that allow DNA to be organized and expressed in the cell nucleus, undergo strict regulation and can be controlled in a variety of different levels. In these, there is a number of chemical modifications of the genomic DNA, that play a key role during the development of mammals and can change significantly in cancer. These modifications partly consist of methylations of different cytosines and are known as genomic methylation patterns. The enzymes responsible for the creation, maintenance and alteration of these patterns are the methyltransferases (Dnmts). The RNA-helicase p68, also known as Ddx5, is known, through literature, to interact directly with the members of the Dnmts family. Ddx5 is a RNA dependent ATPase and a member of the DEAD-box protein family whose function during the translation initiation is that of a co-activator for the steroid receptors and of TP53 (p53), it is thus possibly promoting cell proliferation and/or cell survival. In this study we investigate the expression and subcellular localization of Ddx5 in lung and colon human cancers as well as in different types and origins of cancer artificially induced in mice. We, furthermore, investigated the role of p68/Ddx5 as a possible cancer promoter. Western blot electrophoresis, cell immunochemistry and immunohistochemistry were employed in the course, using a specific antibody for Ddx5. Ddx5 expression levels were manipulated, using molecular technics, in MC38 mouse cancer cells, while we also overexpressed the wild type protein as well as a mutated form of it (Ddx5 mut) which has lost the helicase function and most likely serves as a dominant negative mutation. The role of Ddx5 was also investigated in vivo in mouse models for cancer growth, in experiments of intrapleural or subcutaneous infusion of syngenic cancer cells, modified as to the expression levels of Ddx5. The results derived from the experiments regarding the subcellular localization and expression of Ddx5 clearly showed that the particular RNA helicase acts within the nucleus, whereas the signal intensity seams to increase depending on the malignancy stage, in lung and colon human cancers alike. Ddx5 is detected in two forms, in the Western immunoblot analysis: a slower one and a faster moving one, which is speculated to be a proteolytic product of the first. Silencing of Ddx5 in MC38 cell does not significantly affect the growth of tumors induced in mice, when subcutaneously injected or the collection of malignant pleural infusion. However, the overexpression of the wild type Ddx5, but not that of the mutated protein, seams to offer a growth advantage to MC38 cells, in development of subcutaneous tumors, while overexpression of the mutant Ddx5 in the same cells shows a reduction in the volume of malignant pleural effusion. 2019-06-30T11:13:31Z 2019-06-30T11:13:31Z 2016-05 Thesis http://hdl.handle.net/10889/12247 gr 0 application/pdf |
