Επίδραση μεταλλάξεων του KRAS στη σηματοδότηση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης
Οι μεταλλάξεις της KRAS4B μικρής GTPάσης εμφανίζονται σε μια πληθώρα τύπων καρκίνου και οδηγούν σε μια συνεχώς ενεργό πρωτεΐνη που επηρεάζει πολυάριθμα σηματοδοτικά μονοπάτια, με βασικότερα το σηματοδοτικό καταρράκτη MAP κινασών (MAPK) και το PI3K/AKT/mTOR μονοπάτι. Αυτά καταλήγουν, εκτός άλλων, στη...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2019
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/12450 |
| id |
nemertes-10889-12450 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης Ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης Σηματοδοτικά μονοπάτια Παράγοντες έναρξης της μετάφρασης Μετάλλαξη KRAS Translation initiation Translation initiation regulation MAPK cascade PI3K/AKT/mTOR signalling pathway Eukaryotic initiation factors (eIFs) KRAS mutation 612.398 |
| spellingShingle |
Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης Ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης Σηματοδοτικά μονοπάτια Παράγοντες έναρξης της μετάφρασης Μετάλλαξη KRAS Translation initiation Translation initiation regulation MAPK cascade PI3K/AKT/mTOR signalling pathway Eukaryotic initiation factors (eIFs) KRAS mutation 612.398 Κυριακόπουλος, Γεώργιος Επίδραση μεταλλάξεων του KRAS στη σηματοδότηση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης |
| description |
Οι μεταλλάξεις της KRAS4B μικρής GTPάσης εμφανίζονται σε μια πληθώρα τύπων καρκίνου και οδηγούν σε μια συνεχώς ενεργό πρωτεΐνη που επηρεάζει πολυάριθμα σηματοδοτικά μονοπάτια, με βασικότερα το σηματοδοτικό καταρράκτη MAP κινασών (MAPK) και το PI3K/AKT/mTOR μονοπάτι. Αυτά καταλήγουν, εκτός άλλων, στη ρύθμιση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης μέσω ενεργοποιητικών και ανασταλτικών φωσφορυλιώσεων συγκεκριμένων παραγόντων έναρξης της μετάφρασης (eIFs), με αποτέλεσμα να επηρεάζεται τόσο ο ρυθμός όσο και το σύνολο των mRNAs που μεταφράζονται. Παράλληλα, μέσω των μονοπατιών αυτών, στρατολογείται ο μεταγραφικός παράγοντας c-MYC, ο οποίος ελέγχει τη μεταγραφή και από τις τρεις RNA πολυμεράσες, με αποτέλεσμα να επηρεάζει με τη σειρά του την πρωτεϊνοσύνθεση, μέσω ρύθμισης της βιογένεσης των ριβοσωμάτων, του σχηματισμού του eIF4F συμπλόκου και της μεταγραφής μορίων tRNA.
Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε σε μοριακό επίπεδο η επίδραση της μετάλλαξης KRAS G12C στη ρύθμιση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης σε δύο κυτταρικές σειρές αδε-νοκαρκινώματος πνεύμονα. Έγινε μεταλλαξιγένεση προς mKras2b G12C από mKras2b WT γονίδιο εισάγοντας με PCR σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο, το οποίο στη συνέχεια εντέθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pEGFP-C1. Πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών A549 και CL1-5 και στη συνέχεια έγινε απομόνωση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων. Με τη μέθοδο ανοσοαποτύπωσης κατά Western μελετήθηκε η έκφραση και το ποσοστό φωσφορυλίωσης σημαντικών μορίων που συμμετέχουν στα σηματοδοτικά μονοπάτια RAF/MEK/ERK και PI3K/AKT/mTOR, καθώς και στην έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης. Παρατηρήθηκε ενεργοποίηση των δύο σηματοδοτικών μονοπατιών στις δύο κυτταρικές σειρές, με σημαντικές διαφοροποιήσεις όσον αφορά τα σύμπλοκα mTORC1 και mTORC2. Διακριτός ήταν και ο τρόπος με τον οποίο επηρεάζεται ο σχηματισμός του 43S προεναρκτηρίου συμπλόκου και του eIF4F συμπλόκου έναρξης της εξαρτώμενης από καλύπτρα πρωτεϊνοσύνθεσης στις δύο κυτταρικές σειρές. Φαίνεται, λοιπόν, πως η ρύθμιση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης διαδραματίζεται μέσω εναλλακτικών μηχανισμών στην κάθε κυτταρική σειρά, γεγονός που πιθανώς να οφείλεται στην εμπλοκή διακριτών μεταγραφικών ή/και άλλων παραγόντων στην κάθε περίπτωση. |
| author2 |
Σταθόπουλος, Κωνσταντίνος |
| author_facet |
Σταθόπουλος, Κωνσταντίνος Κυριακόπουλος, Γεώργιος |
| format |
Thesis |
| author |
Κυριακόπουλος, Γεώργιος |
| author_sort |
Κυριακόπουλος, Γεώργιος |
| title |
Επίδραση μεταλλάξεων του KRAS στη σηματοδότηση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης |
| title_short |
Επίδραση μεταλλάξεων του KRAS στη σηματοδότηση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης |
| title_full |
Επίδραση μεταλλάξεων του KRAS στη σηματοδότηση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης |
| title_fullStr |
Επίδραση μεταλλάξεων του KRAS στη σηματοδότηση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης |
| title_full_unstemmed |
Επίδραση μεταλλάξεων του KRAS στη σηματοδότηση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης |
| title_sort |
επίδραση μεταλλάξεων του kras στη σηματοδότηση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης |
| publishDate |
2019 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/12450 |
| work_keys_str_mv |
AT kyriakopoulosgeōrgios epidrasēmetallaxeōntoukrasstēsēmatodotēsētēsenarxēstēsprōteïnosynthesēs AT kyriakopoulosgeōrgios effectofkrasmutationonthesignalingoftranslationinitiation |
| _version_ |
1771297183500337152 |
| spelling |
nemertes-10889-124502022-09-05T09:41:57Z Επίδραση μεταλλάξεων του KRAS στη σηματοδότηση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης Effect of KRAS mutation on the signaling of translation initiation Κυριακόπουλος, Γεώργιος Σταθόπουλος, Κωνσταντίνος Δραΐνας, Διονύσιος Ντίνος, Γεώργιος Kyriakopoulos, Georgios Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης Ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης Σηματοδοτικά μονοπάτια Παράγοντες έναρξης της μετάφρασης Μετάλλαξη KRAS Translation initiation Translation initiation regulation MAPK cascade PI3K/AKT/mTOR signalling pathway Eukaryotic initiation factors (eIFs) KRAS mutation 612.398 Οι μεταλλάξεις της KRAS4B μικρής GTPάσης εμφανίζονται σε μια πληθώρα τύπων καρκίνου και οδηγούν σε μια συνεχώς ενεργό πρωτεΐνη που επηρεάζει πολυάριθμα σηματοδοτικά μονοπάτια, με βασικότερα το σηματοδοτικό καταρράκτη MAP κινασών (MAPK) και το PI3K/AKT/mTOR μονοπάτι. Αυτά καταλήγουν, εκτός άλλων, στη ρύθμιση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης μέσω ενεργοποιητικών και ανασταλτικών φωσφορυλιώσεων συγκεκριμένων παραγόντων έναρξης της μετάφρασης (eIFs), με αποτέλεσμα να επηρεάζεται τόσο ο ρυθμός όσο και το σύνολο των mRNAs που μεταφράζονται. Παράλληλα, μέσω των μονοπατιών αυτών, στρατολογείται ο μεταγραφικός παράγοντας c-MYC, ο οποίος ελέγχει τη μεταγραφή και από τις τρεις RNA πολυμεράσες, με αποτέλεσμα να επηρεάζει με τη σειρά του την πρωτεϊνοσύνθεση, μέσω ρύθμισης της βιογένεσης των ριβοσωμάτων, του σχηματισμού του eIF4F συμπλόκου και της μεταγραφής μορίων tRNA. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε σε μοριακό επίπεδο η επίδραση της μετάλλαξης KRAS G12C στη ρύθμιση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης σε δύο κυτταρικές σειρές αδε-νοκαρκινώματος πνεύμονα. Έγινε μεταλλαξιγένεση προς mKras2b G12C από mKras2b WT γονίδιο εισάγοντας με PCR σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο, το οποίο στη συνέχεια εντέθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pEGFP-C1. Πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών A549 και CL1-5 και στη συνέχεια έγινε απομόνωση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων. Με τη μέθοδο ανοσοαποτύπωσης κατά Western μελετήθηκε η έκφραση και το ποσοστό φωσφορυλίωσης σημαντικών μορίων που συμμετέχουν στα σηματοδοτικά μονοπάτια RAF/MEK/ERK και PI3K/AKT/mTOR, καθώς και στην έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης. Παρατηρήθηκε ενεργοποίηση των δύο σηματοδοτικών μονοπατιών στις δύο κυτταρικές σειρές, με σημαντικές διαφοροποιήσεις όσον αφορά τα σύμπλοκα mTORC1 και mTORC2. Διακριτός ήταν και ο τρόπος με τον οποίο επηρεάζεται ο σχηματισμός του 43S προεναρκτηρίου συμπλόκου και του eIF4F συμπλόκου έναρξης της εξαρτώμενης από καλύπτρα πρωτεϊνοσύνθεσης στις δύο κυτταρικές σειρές. Φαίνεται, λοιπόν, πως η ρύθμιση της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης διαδραματίζεται μέσω εναλλακτικών μηχανισμών στην κάθε κυτταρική σειρά, γεγονός που πιθανώς να οφείλεται στην εμπλοκή διακριτών μεταγραφικών ή/και άλλων παραγόντων στην κάθε περίπτωση. One of the most frequently mutated oncogenes in several types of cancer is KRAS4B, a small GTPase which is constitutively active upon mutations at codons G12, G13 or Q61. KRAS acts as a signal switch molecule that activates mainly two downstream effector pathways, the MAPK cascade and the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway, and regulates diverse cellular processes, including the translation at the initiation step. This occurs at multiple levels and includes activating and inhibiting phosphorylations of certain translation initiation factors (eIFs), thus affecting both the global protein synthesis rates and the set of the mRNAs that are translated. Concomitantly, c-MYC is recruited by these pathways to control transcription by all three RNA polymerases, resulting in rewiring of protein synthesis via modulation of ribosome biogenesis, formation of eIF4F complex and tRNA transcription. In the present study the effects of KRAS G12C mutant on the regulation of translation initiation were investigated at a molecular level in two lung adenocarcinoma cell lines. Generation of the mKras2b G12C mutant using PCR-mediated site-directed mutagenesis was followed by insertion of the coding sequence into the pEGFP-C1 plasmid vector. Transfection of human A549 and CL1-5 cell lines was performed and total protein extracts were isolated. The expression profile and phosphorylation state of important molecules involved in the RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT/mTOR signaling pathways, as well as in the translation initiation process, were studied by Western blot. Activation of the two signaling pathways in the two cell lines was observed, with significant alterations regarding the mTORC1 and mTORC2 complexes. The formation of 43S pre-initiation complex and eIF4F complex of cap-dependent translation was distinctly regulated in the two cell lines. The regulation of translation initiation by this mutant seems to occur through alternate mechanisms in the two cell lines, possibly due to the involvement of distinct transcriptional and/or other factors in each case. In conclusion, we report a divergent response among two epithelial-derived NSCLC cell lines upon induction of the same KRAS mutant regarding the rewiring of protein synthesis. 2019-08-09T09:31:10Z 2019-08-09T09:31:10Z 2018-07-12 Thesis http://hdl.handle.net/10889/12450 gr 12 application/pdf |
