Μεταβολές της RNA-διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης από μεταλλάξεις του K-RAS
Η πρωτεϊνοσύνθεση είναι μια θεμελιώδης διαδικασία του κυττάρου μέσω της οποίας παράγονται όλες οι πρωτεΐνες που απαιτούνται για τη λειτουργία και την επιβίωσή του. Διεκπεραιώνεται μέσω τριών διακριτών βημάτων, με το στάδιο της έναρξης να είναι το καθοριστικό για τον συνολικό ρυθμό της. Στην έναρξη τ...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2019
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/12452 |
| id |
nemertes-10889-12452 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
RNA-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης Μη-κωδικά μόρια RNA Μεταγραφική ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης Παράγοντες έναρξης της μετάφρασης RNA-mediated regulation Translation initiation Non-coding RNAs miRNAs tRNA-derived fragments (tRFs) lncRNAs Eukaryotic initiation factors (eIFs) 612.398 |
| spellingShingle |
RNA-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης Μη-κωδικά μόρια RNA Μεταγραφική ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης Παράγοντες έναρξης της μετάφρασης RNA-mediated regulation Translation initiation Non-coding RNAs miRNAs tRNA-derived fragments (tRFs) lncRNAs Eukaryotic initiation factors (eIFs) 612.398 Κατωπόδη, Βασιλική Μεταβολές της RNA-διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης από μεταλλάξεις του K-RAS |
| description |
Η πρωτεϊνοσύνθεση είναι μια θεμελιώδης διαδικασία του κυττάρου μέσω της οποίας παράγονται όλες οι πρωτεΐνες που απαιτούνται για τη λειτουργία και την επιβίωσή του. Διεκπεραιώνεται μέσω τριών διακριτών βημάτων, με το στάδιο της έναρξης να είναι το καθοριστικό για τον συνολικό ρυθμό της. Στην έναρξη της μετάφρασης συμμετέχει μια πληθώρα παραγόντων (eIFs) οι οποίοι υπόκεινται σε ρύθμιση από δύο σηματοδοτικά μονοπάτια, τα RAF/MEK/ERK και PI3K/AKT/mTOR. Αποτέλεσμα της ρύθμισης αυτής είναι να αναδιαμορφώνεται ο ρυθμός της σύνθεσης νέων πεπτιδίων. Στην πολυπλοκότητα της ρύθμισής της συμβάλλει μια πληθώρα ρυθμιστικών μη-κωδικών μορίων RNA τα οποία μπορούν να στοχεύσουν τη μετάφραση άμεσα, επιδρώντας σε παράγοντες αυτής, ή έμμεσα αλληλεπιδρώντας με μόρια-τελεστές των σηματοδοτικών μονοπατιών που την ελέγχουν. Η μεταγραφή αυτών των μορίων RNA, τα οποία μπορούν να είναι μικρού (microRNAs, tRNAs, tiRs, tRHs) ή και μεγάλου μεγέθους (long non-coding RNAs), ρυθμίζεται τόσο από την πρωτεΐνη KRAS όσο και από τον μεταγραφικό παράγοντα c-MYC που στρατολογείται απ’ την GTPαση. O c-MYC επηρεάζει τη μεταγραφή από όλες τις RNA πολυμεράσες ρυθμίζοντας με τον τρόπο αυτό την πρωτεϊνοσύνθεση σε μεταγραφικό επίπεδο.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η RNA-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης έπειτα από υπερέκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης KRAS G12C σε κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος πνεύμονα. Η mKras2b G12C εντέθηκε σε πλασμιδιακό φορέα pEGFP-C1 με τον οποίο έπειτα διαμολύνθηκαν οι κυτταρικές σειρές Α549 και CL1-5. Χρησιμοποιώντας qPCR έγινε ποσοτικοποίηση μικρών και μεγάλων ρυθμιστικών μη-κωδικών μορίων RNA τα οποία ρυθμίζουν τον c-MYC (MycLos, let7), την KRAS (let7) καθώς και άλλων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης (tRNAs, tRFs, tiRs) και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (miR-26, miR-92,miR-21, miR-411, TERC, MALAT1, GAS5, DANCR). Παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς την έκφραση της πλειοψηφίας των μη-κωδικών RNAs που μελετήθηκαν ανάμεσα στις δύο κυτταρικές σειρές. Στα CL1-5 εντονότερη ήταν η αύξηση των ογκογενών microRNAs και των ογκοκατασταλτικών let7, καθώς και των κυτταροπλασματικών και μιτοχονδριακών θραυσμάτων tRNA, με ηπιότερες μεταβολές στα Α549. Τέλος διαφορική βρέθηκε η έκφραση του c-MYC αφού υπερεκφράζεται σημαντικά στα Α549 ενώ παραμένει σχεδόν αμετάβλητος στα CL1-5. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν πως οι δύο κυτταρικές σειρές πιθανώς χρησιμοποιούν διαφορετικούς μηχανισμούς για τον RNA-διαμεσολαβούμενο επαναπρογραμματισμό της πρωτεϊνοσύνθεσης. |
| author2 |
Σταθόπουλος, Κωνσταντίνος |
| author_facet |
Σταθόπουλος, Κωνσταντίνος Κατωπόδη, Βασιλική |
| format |
Thesis |
| author |
Κατωπόδη, Βασιλική |
| author_sort |
Κατωπόδη, Βασιλική |
| title |
Μεταβολές της RNA-διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης από μεταλλάξεις του K-RAS |
| title_short |
Μεταβολές της RNA-διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης από μεταλλάξεις του K-RAS |
| title_full |
Μεταβολές της RNA-διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης από μεταλλάξεις του K-RAS |
| title_fullStr |
Μεταβολές της RNA-διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης από μεταλλάξεις του K-RAS |
| title_full_unstemmed |
Μεταβολές της RNA-διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης από μεταλλάξεις του K-RAS |
| title_sort |
μεταβολές της rna-διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης από μεταλλάξεις του k-ras |
| publishDate |
2019 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/12452 |
| work_keys_str_mv |
AT katōpodēbasilikē metabolestēsrnadiamesolaboumenēsrythmisēstēsenarxēstēsprōteïnosynthesēsapometallaxeistoukras AT katōpodēbasilikē alterationsinthernamediatedregulationoftranslationinitiationunderkrasmutations |
| _version_ |
1771297321521250304 |
| spelling |
nemertes-10889-124522022-09-05T20:30:24Z Μεταβολές της RNA-διαμεσολαβούμενης ρύθμισης της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης από μεταλλάξεις του K-RAS Alterations in the RNA-mediated regulation of translation initiation under K-RAS mutations Κατωπόδη, Βασιλική Σταθόπουλος, Κωνσταντίνος Δραΐνας, Διονύσιος Ντίνος, Γεώργιος Katopodi, Vasiliki RNA-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης Μη-κωδικά μόρια RNA Μεταγραφική ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης Παράγοντες έναρξης της μετάφρασης RNA-mediated regulation Translation initiation Non-coding RNAs miRNAs tRNA-derived fragments (tRFs) lncRNAs Eukaryotic initiation factors (eIFs) 612.398 Η πρωτεϊνοσύνθεση είναι μια θεμελιώδης διαδικασία του κυττάρου μέσω της οποίας παράγονται όλες οι πρωτεΐνες που απαιτούνται για τη λειτουργία και την επιβίωσή του. Διεκπεραιώνεται μέσω τριών διακριτών βημάτων, με το στάδιο της έναρξης να είναι το καθοριστικό για τον συνολικό ρυθμό της. Στην έναρξη της μετάφρασης συμμετέχει μια πληθώρα παραγόντων (eIFs) οι οποίοι υπόκεινται σε ρύθμιση από δύο σηματοδοτικά μονοπάτια, τα RAF/MEK/ERK και PI3K/AKT/mTOR. Αποτέλεσμα της ρύθμισης αυτής είναι να αναδιαμορφώνεται ο ρυθμός της σύνθεσης νέων πεπτιδίων. Στην πολυπλοκότητα της ρύθμισής της συμβάλλει μια πληθώρα ρυθμιστικών μη-κωδικών μορίων RNA τα οποία μπορούν να στοχεύσουν τη μετάφραση άμεσα, επιδρώντας σε παράγοντες αυτής, ή έμμεσα αλληλεπιδρώντας με μόρια-τελεστές των σηματοδοτικών μονοπατιών που την ελέγχουν. Η μεταγραφή αυτών των μορίων RNA, τα οποία μπορούν να είναι μικρού (microRNAs, tRNAs, tiRs, tRHs) ή και μεγάλου μεγέθους (long non-coding RNAs), ρυθμίζεται τόσο από την πρωτεΐνη KRAS όσο και από τον μεταγραφικό παράγοντα c-MYC που στρατολογείται απ’ την GTPαση. O c-MYC επηρεάζει τη μεταγραφή από όλες τις RNA πολυμεράσες ρυθμίζοντας με τον τρόπο αυτό την πρωτεϊνοσύνθεση σε μεταγραφικό επίπεδο. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η RNA-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης έπειτα από υπερέκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης KRAS G12C σε κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος πνεύμονα. Η mKras2b G12C εντέθηκε σε πλασμιδιακό φορέα pEGFP-C1 με τον οποίο έπειτα διαμολύνθηκαν οι κυτταρικές σειρές Α549 και CL1-5. Χρησιμοποιώντας qPCR έγινε ποσοτικοποίηση μικρών και μεγάλων ρυθμιστικών μη-κωδικών μορίων RNA τα οποία ρυθμίζουν τον c-MYC (MycLos, let7), την KRAS (let7) καθώς και άλλων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης (tRNAs, tRFs, tiRs) και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (miR-26, miR-92,miR-21, miR-411, TERC, MALAT1, GAS5, DANCR). Παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς την έκφραση της πλειοψηφίας των μη-κωδικών RNAs που μελετήθηκαν ανάμεσα στις δύο κυτταρικές σειρές. Στα CL1-5 εντονότερη ήταν η αύξηση των ογκογενών microRNAs και των ογκοκατασταλτικών let7, καθώς και των κυτταροπλασματικών και μιτοχονδριακών θραυσμάτων tRNA, με ηπιότερες μεταβολές στα Α549. Τέλος διαφορική βρέθηκε η έκφραση του c-MYC αφού υπερεκφράζεται σημαντικά στα Α549 ενώ παραμένει σχεδόν αμετάβλητος στα CL1-5. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν πως οι δύο κυτταρικές σειρές πιθανώς χρησιμοποιούν διαφορετικούς μηχανισμούς για τον RNA-διαμεσολαβούμενο επαναπρογραμματισμό της πρωτεϊνοσύνθεσης. Protein synthesis is a fundamental cellular process through which all the proteins needed for the function and survival of the cell are produced. mRNA translation is divided in three steps, but the initiation step is the rate-limiting one. This step employs a plethora of factors, called translation initiation factors (eIFs), and is controlled by two kinase signalling pathways, RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT/mTOR which fine tune the rate of protein synthesis. Translation initiation is not only controlled by these pathways but also through several regulatory non-coding RNAs. Non-coding RNAs affect protein synthesis either directly, by targeting the translation initiation factors, or indirectly through silencing of effector-kinases belonging to the signaling pathways that control translation. The transcription of these RNA molecules, which could be of small (microRNAs, tRNAs, TiRs, tRHs) or large size (long non-coding RNAs), is controlled not only by the oncoprotein KRAS but also from the pleotropic transcription factor c-MYC, who is employed himself by the active GTPase. c-MYC affects the transcription from all RNA polymerases thus regulating protein synthesis at the transcriptional level. This study aims to shed light on the mechanisms involved in the RNA-mediated translation initiation regulation upon overexpression of KRAS G12C mutant in two human lung adenocarcinoma cell lines. mKras2b G12C was cloned into pEGFP-C1 vector which was then used to transfect the A549 and CL1-5 cell lines. The quantification of several small and long regulatory non-coding RNAs involved in the regulation of c-MYC (MycLos, let7), KRAS (let7) as well as of others implicated in the regulation of protein synthesis (tRNAs, tRFs, tiRs) and cell proliferation (miR-26, miR-92, miR-21, miR411, TERC, MALAT1, GAS5, DANCR) was conducted through qPCR. We observed differential expression of most non-coding RNAs between the two cell lines. Upregulation of oncogenic and tumor suppressor microRNAs, as well as of several cytosolic and mitochondrial tRNA-fragments, was greater in CL1-5 rather than A549. Furthermore, the expression profile of c-MYC was found significantly upregulated in A549 cell line whereas in CL1-5, remains unchanged. These results imply that the two cell lines possibly use distinct mechanisms for the RNA-mediated rewiring of protein synthesis. 2019-08-09T09:39:06Z 2019-08-09T09:39:06Z 2018-07-12 Thesis http://hdl.handle.net/10889/12452 gr 12 application/pdf |
