| Περίληψη: | Το μονοπάτι της ουβικιτίνης είναι ένας καταρράκτης αντιδράσεων ο οποίος καταλήγει στην ομοιοπολική πρόσδεση μορίων ουβικιτίνης σε πρωτεϊνικά υποστρώματα. Η μετα-μεταφραστική αυτή τροποποίηση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εύρυθμη λειτουργία ενός κυττάρου και εμπλέκεται στη ρύθμιση πολλών βασικών κυτταρικών διαδικασιών, όπως ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση. Η πιο αποσαφηνισμένη λειτουργία του μονοπατιού ουβικιτίνης είναι η σηματοδότηση προς αποικοδόμηση των πολυ-ουβικιτινιωμένων πρωτεϊνών από το πρωτεάσωμα 26S.
Για την ομοιοπολική σύνδεση της ουβικιτίνης απαιτείται η δράση τριών ενζύμων, του Ε1 ενζύμου ενεργοποίησης της ουβικιτίνης, του Ε2 ενζύμου μεταφορέα της ουβικιτίνης και της E3 λιγάσης. Η Ε3 λιγάση αναγνωρίζει το κατάλληλο Ε2 ένζυμο και την πρωτεΐνη-στόχο και καταλύει τη μεταφορά της ουβικιτίνης. Οι RING πρωτεΐνες αποτελούν τη μεγαλύτερη οικογένεια Ε3 λιγάσων και χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη ενός μοτίβου δέσμευσης δύο ιόντων ψευδαργύρου, το οποίο ονομάζεται RING τομέας. Μέσω του RING τομέα τους επιτυγχάνεται η αναγνώριση του κατάλληλου Ε2 ενζύμου. Η πρωτεΐνη Arkadia-2C (Αrk2C) είναι μια RING-H2 Ε3 λιγάση, η οποία ενισχύει τη σηματοδότηση του BMP μονοπατιού σηματοδοτώντας προς αποικοδόμηση αρνητικούς ρυθμιστές του μονοπατιού.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία, αρχικά εκφράστηκε και απομονώθηκε σε υψηλή συγκέντρωση και καθαρότητα το Ε2 ένζυμο UbcH7 με στόχο τη δομική του μελέτη μέσω φασματοσκοπίας NMR. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του ενζύμου με τον αγρίου τύπου RING-H2 τομέα της Ark2C. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η αυτο-ουβικιτινίωση της αγρίου τύπου Αrk2C παρουσία των Ε2 ενζύμων UbcH7 και UbcH5B και συγκρίθηκε η αποτελεσματικότητά της ως προς τη μεταφορά της ουβικιτίνης. Μέσω δοκιμασιών αυτο-ουβικιτινίωσης ελέγχθηκε, επίσης, η δράση τόσο του RING τομέα καθώς και ενός μεγαλύτερου πολυπεπτιδικού τμήματος, το οποίο περιλαμβάνει επιπλέον τις ακολουθίες TRG και TIER. Επιπλέον, μελετήθηκε η ικανότητα αλληλεπίδρασης του RING-H2 τομέα της Ark2C και του μεγαλύτερου πολυπεπτιδικού τμήματος με ελεύθερη ουβικιτίνη. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση των μεταλλαξέων του συντηρημένου καταλοίπου Trp του RING-H2 τομέα της Ark2C (W324R και W324A) στην αλληλεπίδραση με τα Ε2 ένζυμα UbcH7 και UbcH5B και στη δράση της πρωτεΐνης ως Ε3 λιγάση.
|
|---|
