Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι της ουβικιτίνης
Το μονοπάτι της ουβικιτίνης είναι ένας καταρράκτης αντιδράσεων ο οποίος καταλήγει στην ομοιοπολική πρόσδεση μορίων ουβικιτίνης σε πρωτεϊνικά υποστρώματα. Η μετα-μεταφραστική αυτή τροποποίηση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εύρυθμη λειτουργία ενός κυττάρου και εμπλέκεται στη ρύθμιση πολλών βασικών...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2019
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/12455 |
| id |
nemertes-10889-12455 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
E3 λιγάση RING τομέας Φασματοσκοπία ΝΜR Arkadia-2C E3 ligase RING domain NMR spectroscopy 572.76 |
| spellingShingle |
E3 λιγάση RING τομέας Φασματοσκοπία ΝΜR Arkadia-2C E3 ligase RING domain NMR spectroscopy 572.76 Σελιάμη, Αναστασία Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι της ουβικιτίνης |
| description |
Το μονοπάτι της ουβικιτίνης είναι ένας καταρράκτης αντιδράσεων ο οποίος καταλήγει στην ομοιοπολική πρόσδεση μορίων ουβικιτίνης σε πρωτεϊνικά υποστρώματα. Η μετα-μεταφραστική αυτή τροποποίηση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εύρυθμη λειτουργία ενός κυττάρου και εμπλέκεται στη ρύθμιση πολλών βασικών κυτταρικών διαδικασιών, όπως ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση. Η πιο αποσαφηνισμένη λειτουργία του μονοπατιού ουβικιτίνης είναι η σηματοδότηση προς αποικοδόμηση των πολυ-ουβικιτινιωμένων πρωτεϊνών από το πρωτεάσωμα 26S.
Για την ομοιοπολική σύνδεση της ουβικιτίνης απαιτείται η δράση τριών ενζύμων, του Ε1 ενζύμου ενεργοποίησης της ουβικιτίνης, του Ε2 ενζύμου μεταφορέα της ουβικιτίνης και της E3 λιγάσης. Η Ε3 λιγάση αναγνωρίζει το κατάλληλο Ε2 ένζυμο και την πρωτεΐνη-στόχο και καταλύει τη μεταφορά της ουβικιτίνης. Οι RING πρωτεΐνες αποτελούν τη μεγαλύτερη οικογένεια Ε3 λιγάσων και χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη ενός μοτίβου δέσμευσης δύο ιόντων ψευδαργύρου, το οποίο ονομάζεται RING τομέας. Μέσω του RING τομέα τους επιτυγχάνεται η αναγνώριση του κατάλληλου Ε2 ενζύμου. Η πρωτεΐνη Arkadia-2C (Αrk2C) είναι μια RING-H2 Ε3 λιγάση, η οποία ενισχύει τη σηματοδότηση του BMP μονοπατιού σηματοδοτώντας προς αποικοδόμηση αρνητικούς ρυθμιστές του μονοπατιού.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία, αρχικά εκφράστηκε και απομονώθηκε σε υψηλή συγκέντρωση και καθαρότητα το Ε2 ένζυμο UbcH7 με στόχο τη δομική του μελέτη μέσω φασματοσκοπίας NMR. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του ενζύμου με τον αγρίου τύπου RING-H2 τομέα της Ark2C. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η αυτο-ουβικιτινίωση της αγρίου τύπου Αrk2C παρουσία των Ε2 ενζύμων UbcH7 και UbcH5B και συγκρίθηκε η αποτελεσματικότητά της ως προς τη μεταφορά της ουβικιτίνης. Μέσω δοκιμασιών αυτο-ουβικιτινίωσης ελέγχθηκε, επίσης, η δράση τόσο του RING τομέα καθώς και ενός μεγαλύτερου πολυπεπτιδικού τμήματος, το οποίο περιλαμβάνει επιπλέον τις ακολουθίες TRG και TIER. Επιπλέον, μελετήθηκε η ικανότητα αλληλεπίδρασης του RING-H2 τομέα της Ark2C και του μεγαλύτερου πολυπεπτιδικού τμήματος με ελεύθερη ουβικιτίνη. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση των μεταλλαξέων του συντηρημένου καταλοίπου Trp του RING-H2 τομέα της Ark2C (W324R και W324A) στην αλληλεπίδραση με τα Ε2 ένζυμα UbcH7 και UbcH5B και στη δράση της πρωτεΐνης ως Ε3 λιγάση. |
| author2 |
Σπυρούλιας, Γεώργιος |
| author_facet |
Σπυρούλιας, Γεώργιος Σελιάμη, Αναστασία |
| format |
Thesis |
| author |
Σελιάμη, Αναστασία |
| author_sort |
Σελιάμη, Αναστασία |
| title |
Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι της ουβικιτίνης |
| title_short |
Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι της ουβικιτίνης |
| title_full |
Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι της ουβικιτίνης |
| title_fullStr |
Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι της ουβικιτίνης |
| title_full_unstemmed |
Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι της ουβικιτίνης |
| title_sort |
μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι της ουβικιτίνης |
| publishDate |
2019 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/12455 |
| work_keys_str_mv |
AT seliamēanastasia meletētēsschesēsdomēsdrastikotētasenzymōntaopoiaemplekontaistomonopatitēsoubikitinēs |
| _version_ |
1771297172477706240 |
| spelling |
nemertes-10889-124552022-09-05T06:57:58Z Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι της ουβικιτίνης Σελιάμη, Αναστασία Σπυρούλιας, Γεώργιος Σπυρούλιας, Γεώργιος Μαγκαφά, Βασιλική Πατρινός, Γεώργιος Seliami, Anastasia E3 λιγάση RING τομέας Φασματοσκοπία ΝΜR Arkadia-2C E3 ligase RING domain NMR spectroscopy 572.76 Το μονοπάτι της ουβικιτίνης είναι ένας καταρράκτης αντιδράσεων ο οποίος καταλήγει στην ομοιοπολική πρόσδεση μορίων ουβικιτίνης σε πρωτεϊνικά υποστρώματα. Η μετα-μεταφραστική αυτή τροποποίηση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εύρυθμη λειτουργία ενός κυττάρου και εμπλέκεται στη ρύθμιση πολλών βασικών κυτταρικών διαδικασιών, όπως ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση. Η πιο αποσαφηνισμένη λειτουργία του μονοπατιού ουβικιτίνης είναι η σηματοδότηση προς αποικοδόμηση των πολυ-ουβικιτινιωμένων πρωτεϊνών από το πρωτεάσωμα 26S. Για την ομοιοπολική σύνδεση της ουβικιτίνης απαιτείται η δράση τριών ενζύμων, του Ε1 ενζύμου ενεργοποίησης της ουβικιτίνης, του Ε2 ενζύμου μεταφορέα της ουβικιτίνης και της E3 λιγάσης. Η Ε3 λιγάση αναγνωρίζει το κατάλληλο Ε2 ένζυμο και την πρωτεΐνη-στόχο και καταλύει τη μεταφορά της ουβικιτίνης. Οι RING πρωτεΐνες αποτελούν τη μεγαλύτερη οικογένεια Ε3 λιγάσων και χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη ενός μοτίβου δέσμευσης δύο ιόντων ψευδαργύρου, το οποίο ονομάζεται RING τομέας. Μέσω του RING τομέα τους επιτυγχάνεται η αναγνώριση του κατάλληλου Ε2 ενζύμου. Η πρωτεΐνη Arkadia-2C (Αrk2C) είναι μια RING-H2 Ε3 λιγάση, η οποία ενισχύει τη σηματοδότηση του BMP μονοπατιού σηματοδοτώντας προς αποικοδόμηση αρνητικούς ρυθμιστές του μονοπατιού. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, αρχικά εκφράστηκε και απομονώθηκε σε υψηλή συγκέντρωση και καθαρότητα το Ε2 ένζυμο UbcH7 με στόχο τη δομική του μελέτη μέσω φασματοσκοπίας NMR. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του ενζύμου με τον αγρίου τύπου RING-H2 τομέα της Ark2C. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η αυτο-ουβικιτινίωση της αγρίου τύπου Αrk2C παρουσία των Ε2 ενζύμων UbcH7 και UbcH5B και συγκρίθηκε η αποτελεσματικότητά της ως προς τη μεταφορά της ουβικιτίνης. Μέσω δοκιμασιών αυτο-ουβικιτινίωσης ελέγχθηκε, επίσης, η δράση τόσο του RING τομέα καθώς και ενός μεγαλύτερου πολυπεπτιδικού τμήματος, το οποίο περιλαμβάνει επιπλέον τις ακολουθίες TRG και TIER. Επιπλέον, μελετήθηκε η ικανότητα αλληλεπίδρασης του RING-H2 τομέα της Ark2C και του μεγαλύτερου πολυπεπτιδικού τμήματος με ελεύθερη ουβικιτίνη. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση των μεταλλαξέων του συντηρημένου καταλοίπου Trp του RING-H2 τομέα της Ark2C (W324R και W324A) στην αλληλεπίδραση με τα Ε2 ένζυμα UbcH7 και UbcH5B και στη δράση της πρωτεΐνης ως Ε3 λιγάση. The ubiquitin pathway is an enzymatic cascade, which catalyzes the attachment of ubiquitin to protein substrates. This posttranslational modification plays an important role in cell physiology and is implicated in crucial cell processes, such as proliferation and apoptosis. The most studied function of the ubiquitin pathway is the degradation of poly-ubiquitinated proteins by the proteasome 26S. The covalent attachment of ubiquitin to protein substrates occurs through the action of three enzymes, an E1 ubiquitin-activating enzyme, an E2 ubiquitin-conjugating enzyme and an E3 ubiquitin ligase. An E3 ligase recognizes the appropriate E2 enzyme and catalyzes the ubiquitin transfer to the protein substrate. Most E3 ligases are characterized by the presence of a motif, which binds two zinc ions and is called RING domain. The RING domain is implicated in the recognition of E2 enzymes. Arkadia-2C is a RING-H2 E3 ligase, which targets the negative regulators of BMP pathway for degradation and enhances BMP signaling. In the present study, UbcH7 was expressed in high yield with the aim of its structural study through NMR spectroscopy. Its ability to interact with the wild type RING-H2 domain of Ark2C was also studied through NMR titration experiments. In addition, auto-ubiquitination of wild type Ark2C in the presence of Ε2 enzymes UbcH7 and UbcH5B was studied and its E3 ligase activity was compared. Through auto-ubiquitination assays the E3 ligase activity both of Ark2C RING-H2 domain and a longer construct, that contains also TRG and TIER sequences, was studied, too. Furthermore, the ability of these constructs to interact with noncovalent ubiquitin was studied. Last but not least, the effect of two mutations in conserved Trp residue of the Ark2C RING-H2 domain (W324R and W324A) was studied through interaction experiments with E2 enzymes UbcH7 and UbcH5B and auto-ubiquitination assays. 2019-08-09T09:46:16Z 2019-08-09T09:46:16Z 2018-07-11 Thesis http://hdl.handle.net/10889/12455 gr 12 application/pdf |
