Μελέτη του ρόλου του κυτταροσκελετού της δεσμίνης στο μηχανισμό του κυτταρικού θανάτου σε καρδιοπάθειες : πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις

• Main Author: Κουλουμέντα, Ασημίνα
• Other Authors: Μίντζας, Αναστάσιος
• Format: Thesis
• Language: Greek
• Published: 2009
• Subjects: Δεσμίνη; Μυοσπρίνη; Βιογένεση λυσοσωμάτων; Πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις; Desmin; Myosprin; Lysosomes biogenesis; Protein interactions; 571.936

Το επιστημονικό ενδιαφέρον της παρούσας διδακτορικής διατριβής εστιάζεται στο ρόλο του κυτταροσκελετού της δεσμίνης (desmin), της μυοειδικής πρωτεΐνης, μέλος της οικογένειας των ενδιάμεσων ινιδίων, στη διατήρηση και τη λειτουργία του καρδιακού μυός. H καταστολή της έκφρασης της δεσμίνης σε μύες με τη χρησιμοποίηση της γονιδιακής στόχευσης, έδειξε πως η έκφραση της δεσμίνης είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της λειτουργικής και δομικής ακεραιότητας του καρδιακού μυός. Μύες που δεν εκφράζουν δεσμίνη αναπτύσσουν διατατική καρδιομυοπάθεια, που χαρακτηρίζεται από ανωμαλίες σε υποκυτταρικά οργανίδια, όπως είναι τα μιτοχόνδρια, εκτεταμένη ίνωση και εναπόθεση ασβεστίου, με επακόλουθο τον κυτταρικό θάνατο, και τελικά την καρδιακή ανεπάρκεια. Πιο συγκεκριμένα σε μια προσπάθεια διερεύνησης της βιολογικής δράσης της δεσμίνης, μελετήθηκαν οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις αυτού του μορίου. Η ανεύρεση μορίων με τα οποία η δεσμίνη αλληλεπιδρά μπορεί να δώσει σημαντικές πληροφορίες για τη βιολογικής της δράση και να βοηθήσει στην κατανόηση της παθολογίας που παρατηρείται σε επίμυς όπου έχει κατασταλεί η έκφρασή της (διαγονιδιακό μοντέλο διατατικής καρδιομυοπάθειας που έχει δημιουργηθεί από το εργαστήριό μας, des-/-) ή σε ασθενείς με καρδιομυοπάθειες εξαιτίας μεταλλαγών στο μόριο της δεσμίνης. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε η μέθοδος του διυβριδικού συστήματος ζύμης (Yeast two-hybrid), όπου χρησιμοποιήθηκε τμήμα του μορίου της δεσμίνης (το αμινο-τελικό άκρο), με το οποίο ‘σαρώθηκε’ (screening) μια cDNA καρδιακή βιβλιοθήκη, και βρέθηκε ένας αριθμός δυνητικών αλληλεπιδράσεων. Η σάρωση αποκάλυψε την αλληλεπίδραση της δεσμίνης με ένα νέο μόριο, τη Myospryn, μια μυοειδική πρωτεΐνη 413 kDa, μέλος της οικογένειας των TRIM-like πρωτεϊνών. Η πρωτεΐνη myospryn βρέθηκε αρχικά να αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη dysbindin, η οποία εμπλέκεται σε διαδικασίες διαμετακίνησης πρωτεϊνών, κυστιδίων και βιοσύνθεσης οργανιδίων, και αποτελεί συστατικό ενός πρωτεϊνικού συμπλόκου υπεύθυνου για τη βιογένεση λυσοσωμάτων και λυσοσωματικά συσχετιζόμενων οργανιδίων, γνωστό ως Biogenesis of Lysosome Related Organelles (BLOC-1). Η πρόσδεση της δεσμίνης με τη myospryn επαληθεύτηκε με in vitro μεθόδους (GST pull down assay, Co-immunoprecipitation). H ανάλυση ανοσοαποτύπωσης (western blot) απεκάλυψε ότι το ανοσολογικό σύμπλοκο που κατακρημνίζεται με χρήση αντισωμάτων δεσμίνης περιέχει, εκτός της myospryn, και δυο τουλάχιστον υπομονάδες του πρωτεϊνικού συμπλόκου BLOC-1, dysbindin και pallidin. Πειράματα με το δι-υβριδικό σύστημα ζύμης απεκάλυψαν την ακριβή περιοχή αλληλεπίδρασης των δύο πρωτεϊνών, και η οποία περιλαμβάνει τα αα58-103 του αμινο-τελικού άκρου της δεσμίνης και τα τελευταία 24αα του καρβόξυ-τελικού άκρου του μορίου της myospryn, που αντιστοιχούν στο SPRY τμήμα του TRIM-like μοτίβου της οικογένειας των πρωτεϊνών στην οποία ανήκει η myospryn. Πειράματα ανοσοφθορισμού σε απομονωμένα καρδιομυοκύτταρα απεκάλυψαν ότι η myospryn τοπολογείται στην περιφέρεια του πυρήνα, σε στενή γειτνίαση με τις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου, και στο σημείο αυτό αλληλο-επικαλύπτεται με τη δεσμίνη, η οποία σχηματίζει ένα δίκτυο ινιδίων που διατρέχει όλο το μήκος του κυττάρου. Στον ενήλικο καρδιακό ιστό, η myospryn βρίσκεται κυρίως στους εμβόλιμους δίσκους, καθώς και στο επίπεδο της πλασματικής μεμβράνης, του σαρκολείματος, όπου και αλληλοεπικαλύπτεται με τη δεσμίνη. Η αλληλο-επικάλυψη των δυο πρωτεϊνών είναι έντονη στο επίπεδο των εμβόλιμων δίσκων. Δείχθηκε πως η myospryn άλληλο-επικαλύπτεται με τα λυσοσώματα καθώς και ότι η δεσμίνη είναι απαραίτητη τόσο για τη σωστή τοπολόγηση της myospryn, όσο και για αυτήν των λυσοσωμάτων. Τέλος, με πειράματα καταστολής τηw έκφρασης της myospryn, αποκαλύφθηκε πως η παρουσία της myospryn είναι απαραίτητη προκειμένου η δεσμίνη να μπορεί να ανοσοκατακρημνίσει τις υπομονάδες του BLOC-1, dysbindin και pallidin Τέλος, στην προσπάθεια χαρακτηρισμού του λειτουργικού ρόλου της myospryn συμπεριλήφθηκε η χρησιμοποίηση του μοντέλου του D. rerio (zebrafish). Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία των antisense morpholinos, ήταν δυνατή η παρεμπόδιση της έκφρασης της myospryn και η μελέτη των επιπτώσεων στην ανάπτυξη και λειτουργία του καρδιακού ιστού. Η καταστολή της έκφρασης της myospryn είχε ως αποτέλεσμα σοβαρές δομικές και λειτουργικές ανωμαλίες στο καρδιακό σύστημα ατόμων Danio rerio, καταδεικνύοντας την σπουδαιότητα αυτού του μορίου στην ανάπτυξη του καρδιακού συστήματος του D.rerio. Συμπερασματικά η παρούσα διδακτορική διατριβή διαπραγματεύεται τις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις της μυοειδικής πρωτεΐνης δεσμίνης, αποκαλύπτοντας νέους ρυθμιστικούς ρόλους για το μόριο αυτό.