In vitro και in vivo μελέτες των μεταλλαγμάτων του glyS T-box ριβοδιακόπτη από τον σταφυλόκοκκο S. aureus

• Κύριος συγγραφέας: Γιαρίμογλου, Νικολέτα
• Άλλοι συγγραφείς: Σταθόπουλος, Κωνσταντίνος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2019
• Θέματα: T-box ριβοδιακόπτης; Συνθετάση glycyl-tRNA; Ρύθμιση της μεταγραφής; Αντιβιοτικά; Staphylococcus aureus; T-box riboswitch; Glycyl-tRNA synthetase; Transcription regulation; Antibiotics; tRNA; 572.88

Oι T-box ριβοδιακόπτες είναι σημαντικά tRNA-εξαρτώμενα μη-κωδικά RNAs που ρυθμίζουν την έκφραση του 10% του γονιδιώματος των Gram (+) παθογόνων βακτηρίων. Στον Staphylococcus aureus, υπάρχει ένας T-box ριβοδιακόπτης πριν από το γονίδιο glyS που ρυθμίζει τη μεταγραφή της μοναδικής γλυκυλ-tRNA συνθετάσης, η οποία αμινοακυλιώνει πέντε ισοδεκτικά μόρια tRNAGly με αντικωδικόνια GCC ή UCC. Ο ριβοδιακόπτης αυτός φέρει ασυνήθιστα δομικά χαρακτηριστικά όπως το ειδο-ειδικό στέλεχος Sa κι ένας μεγάλός βρόγχος apical. Tα tRNAsGly χρησιμεύουν στην παροχή γλυκίνης είτε κατά τη διαδικασία της μετάφρασης, είτε για τη σταθεροποίηση του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος. Πρόσφατα βρέθηκε ότι ειδικοί αναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης μπορούν να ρυθμίζουν άμεσα την T-box μεσολαβούμενη μεταγραφή. Παρουσία της τιγεκυκλίνης παρατηρήθηκε σημαντική ενίσχυση της T-box ελεγχόμενης μεταγραφής, ενώ παρουσία άλλων, όπως η λινεζολίδη, προκαλείται σημαντική αναστολή. Με την αποκάλυψη της κρυσταλλικής δομής των T-boxes διάφορα νουκλεοτίδια βρέθηκαν να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη δομή αντιτερματισμού του glQS T-box. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος διαφόρων τμημάτων του S.aureus glyS T-box στην T-box διαμεσολαβούμενη μεταγραφή, δημιουργήθηκαν μεταλλάγματα του glyS T-box, με εναλλαγή όμοιων τμημάτων από Τ-boxes από βάκιλους ή με ολική αφαίρεση τμημάτων. Με in vitro δοκιμές μεταγραφής διευκρινίστηκαν τα λειτουργικά μεταλλάγματα και φάνηκε ότι η εναλλαγή τμημάτων μεταξύ των T-box ριβοδιακοπτών από διαφορετικά είδη οδήγησε σε απώλεια λειτουργίας των ριβοδιακοπτών. Μέσω in vitro δοκιμών μεταγραφής διευκρινίστηκε ότι η απώλεια του τμήματος Sa, οδηγεί σε μειωμένη in vitro μεταγραφή παρουσία τιγεκυκλίνης και λινεζολίδης αλλά και απουσία αυτών, καθιστώντας το τμήμα Sa σημαντικό στην ενίσχυση της μεταγραφής που βρέθηκε στον ολόκληρο glyS T-box. Κατόπιν με τη μεθοδολογία primer extension χαρακτηρίστηκαν οι θέσεις πρόσδεσης του tRNAGlyGCC από τον S.aureus καθώς και των αναστολέων της πρωτεϊνοσύνθεσης τιγεκυκλίνη και λινεζολίδη στα μεταλλάγματα αυτά. Επιπλέον, μεταλλάξεις σε κρίσιμα νουκλεοτίδια του tRNAGlyGCC elbow έδειξαν ότι το στέλεχος Ι αδυνατεί να διακρίνει τα ισοδεκτικά μόρια tRNAGly και αυτός ο φαινότυπος αντιστρέφεται όταν το στέλεχος Sa διαγράφεται. Τέλος, με in vivo μεθοδολογία ελέγχθηκαν μεταλλάγματα του glyQ T-box του Geobacillus kaustophilus μετά τη δημιουργία σημειακών μεταλλάξεων σε 3 διαφορετικά, σημαντικά για τον ριβοδιακόπτη νουκλεοτίδια, που συμμετέχουν στη δημιουργία μίας τοπικής διαμόρφωσης. Οι σημειακές μεταλλάξεις οδήγησαν σε αποδιοργάνωση της λειτουργίας του, υποδηλώνοντας τη σημασία της σωστής διαμόρφωσης στην ορθή λειτουργία του T-box συστήματος.