Έκφραση και απομόνωση των ανθρώπινων μεταγραφικών παραγόντων E2F4, E2F5 και TFDP1 για μελέτες μέσω φασματοσκοπίας NMR

• Κύριος συγγραφέας: Μοσχίδη, Δανάη-Καλλιόπη
• Άλλοι συγγραφείς: Σπυρούλιας, Γεώργιος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2019
• Θέματα: Κυτταρικός κύκλος; Πρωτεΐνη Geminin; Φασματοσκοπία NMR; Cell cycle; Geminin; Cdt1; Idas; GemC1; E2F4; E2F5; TFDP1; NMR spectroscopy; 572.645

Ο κυτταρικός κύκλος αποτελεί μία από τις θεμέλιες διαδικασίες για τη βιωσιμότητα του κυττάρου. Η ακρίβεια και η ορθή έκβαση της αντιγραφής του γενετικού υλικού είναι αναγκαία προϋπόθεση για το σωστό πολλαπλασιασμό του κυττάρου. Πιθανά λάθη έχουν ως αποτέλεσμα ποικιλία μεταλλάξεων, οι οποίες οδηγούν σε εκδήλωση κληρονομικών νοσημάτων, διαφόρων μορφών καρκίνου, αλλά και άλλων παθήσεων. Η αδειοδότηση της αντιγραφής είναι καθοριστική για την έναρξη του κυτταρικού κύκλου και πραγματοποιείται κατά μεγάλο βαθμό από την αρνητική ρύθμιση του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1. Η πρωτεΐνη Geminin αποτελεί τον φυσικό αναστολέα του παράγοντα αυτού. Εκτός από την πρωτεΐνη αυτή, η υπεροικογένεια Geminin περιλαμβάνει και άλλα δύο μέλη, Idas και GemC1/Lynkeas, τα οποία αποτελούν ορθόλογα της Geminin. Και τα τρία μέλη της οικογένειας αυτής έχουν σημαντικό ρόλο στη «μοίρα» των κυττάρων, καθώς συμμετέχουν καθοριστικά στις διαδικασίες της αντιγραφής και της διαφοροποίησής τους. Η πρωτεΐνη Idas αλληλεπιδρά με τη πρωτεΐνη Geminin με σκοπό να αναστείλει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών Cdt1 και Geminin και η πρωτεΐνη GemC1 αλληλεπιδρά με το TopBP1 και ρυθμίζει την «στρατολόγηση» του Cdc45 στη χρωματίνη, που αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την ενεργοποίηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου της αντιγραφής. Η έναρξη της αντιγραφής του γενετικού υλικού ελέγχεται μέσω της οδού Rb-E2F και ρυθμίζεται αυστηρά από θετικά και αρνητικά σήματα ρυθμιστικής ανάπτυξης. Αρνητικοί ρυθμιστές της κυτταρικής διαίρεσης αποτελούν τα μέλη της οικογένειας «πρωτεϊνών τσέπης» Rb, pRb, p107 και p130, με την πρωτεΐνη pRb να είναι ο ισχυρότερος καταστολέας της οικογένειας και η απορρύθμιση της οποίας οδηγεί σε μία πλειονότητα περιπτώσεων καρκίνου. Τα μέλη της οικογένειας αυτής δεν έχουν την ικανότητα δέσμευσης DNA και ως εκ τούτου διάφορα μέλη των μεταγραφικών παραγόντων E2F είναι απαραίτητα για τη σύνδεσή τους στο DNA. Οι μεταγραφικοί παράγοντες αυτής της οικογένειας σχηματίζουν ετεροδιμερή με έναν από τους δύο μεταγραφικούς παράγοντες DP, με απόρροια την ενίσχυση της πρόσδεσή τους με τις «πρωτεΐνες τσέπης» και το DNA, καθώς και ενισχύεται η διενεργοποίηση των ίδιων των E2Fs. Είναι φανερό ότι είναι αναγκαίος ο προσδιορισμός της μοριακής βάσης και του μηχανισμού αλληλεπίδρασης αυτών των πρωτεϊνών για τη σωστή λειτουργία του κυτταρικού κύκλου. Για αυτό το λόγο, σκοπός αυτής της ερευνητικής εργασίας τέθηκε σε πρώτο στάδιο, ο προσδιορισμός των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης των πρωτεϊνών και των συμπλόκων τους και εν συνεχεία η μελέτη της δομής τους μέσω της Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy – NMR Spectroscopy). Οι πρωτεΐνες, οι οποίες μελετήθηκαν ήταν οι εξής: το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης Lynkeas/GemC1 (GemC1), το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης Idas (Idas), η περιοχή διμερισμού της πρωτεΐνης E2F4 (ccE2F4), η περιοχή διμερισμού της πρωτεΐνης E2F5 (ccE2F5), η περιοχή διμερισμού της πρωτεΐνης TFDP1 (ccTFDP1) και διευρυμένες περιοχές διμερισμού των πρωτεϊνών E2F5 (exE2F5) και TFDP1 (exTFDP1). Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι η έκφραση των πρωτεϊνών ξεχωριστά ως μονομερή αποδείχθηκε δύσκολη με μόνη δυνατότητα έκφρασης σε υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης E2F5, η σταθερότητα της οποίας όμως αποδείχθηκε απαγορευτική για συνέχιση των NMR πειραμάτων. Σύμφωνα με τα ανωτέρω, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η περιοχή διμερισμού των πρωτεϊνών E2F4, E2F5 και TFDP1 δεν είναι αρκετή για την έκφραση και την αλληλεπίδρασή τους. Η έκφραση και η απομόνωση βέβαια των πρωτεϊνών με διευρυμένη περιοχή διμερισμού, exE2F5 και exTFDP1 ως μονομερή δεν ήταν ομοίως εφικτή. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασής τους όταν πραγματοποιήθηκε συνέκφρασή τους στο ίδιο κύτταρο έκφρασης, καθώς και ο χειρισμός τους κατά τη διάρκεια της απομόνωσής τους σαν σύμπλοκο, έθεσε τα θεμέλια για περαιτέρω μελέτη αυτού του συστήματος και καταγραφή NMR φασμάτων. Τέλος, έγινε προσπάθεια προσδιορισμού της αλληλεπίδρασής της πρωτεΐνης GemC1 παρουσία του συμπλόκου exE2F5-exTFDP1 μέσω τιτλοδότησης σε διάφορες αναλογίες. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης GemC1 όμως δεν ήταν ικανοποιητική, ώστε να μπορεί να προκύψει κάποιο ασφαλές συμπέρασμα για τη μετακίνηση των κορυφών στα φάσματα, το οποίο προμηνύει την ύπαρξη αλληλεπίδρασης προσδιορίσιμης μέσω της φασματοσκοπίας NMR.