Μορφογένεση της επιδερμίδας : μελέτη της υδατανθρακικής συστάσεως των κυτταροπλασματικών μεμβρανών

• Κύριος συγγραφέας: Μπανταβάνης, Γεώργιος Ι.
• Άλλοι συγγραφείς: Τσαμπάος, Διονύσιος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2009
• Θέματα: Κυτταροπλασματικές μεμβράνες; Λεκτίνες; Plasma cell membranes; Lektins; 571.64

Οι υδατάνθρακες αποτελούν βασικά δομικά στοιχεία των κυτταροπλασματικών μεμβρανών, ως συστατικά των μορίων γλυκοπρωτεϊνών, γλυκοζαμινογλυκανών ή γλυκολιπιδίων. Είναι πλέον γνωστό ότι οι υδατάνθρακες δεν αποτελούν απλά ενεργειακά αποθέματα αλλά μόρια υψίστης λειτουργικής σημασίας, τα οποία δρουν ρυθμιστικά στον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των κυττάρων και συμμετέχουν σε διεργασίες όπως η κυτταρική αναγνώριση και προσκόλληση, η λειτουργία υποδοχέα, η λήψη και η μεταγωγή μηνυμάτων, ο καθορισμός της αντιγονικότητας, η αντιπρωτεολυτική και ανοσοδυναμική δράση κ.α. Οι λεκτίνες είναι πρωτεΐνικά ή γλυκοπρωτεΐνικά μόρια φυτικής ή ζωικής προελεύσεως, τα οποία έχουν την ιδιότητα της ειδικής και αναστρέψιμης συνδέσεως με υδατανθρακικές ομάδες της κυτταρικής επιφάνειας, της διάμεσης θεμέλιας ουσίας ή ελεύθερων γλυκολιπιδίων και γλυκοπρωτεϊνών, την χημική σύσταση των οποίων δεν αλλοιώνουν. Η χρήση ειδικά σεσημασμένων λεκτινών στα πλαίσια ιστοχημείας, ανοσοϊστοχημείας, ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, ραδιοαπεικονιστικών και άλλων μεθόδων, προσφέρει ένα θαυμάσιο εργαλείο για τη μελέτη και κατευθυνόμενη τροποποίηση της μεμβρανικής υδατανθρακικής συστάσεως. Παρά τα σημαντικά βήματα προόδου στην μοριακή ανατομία κατά τα τελευταία έτη, οι γνώσεις μας για τη μορφογένεση του ανθρώπινου δέρματος είναι σχετικά περιορισμένες. Η ιδιαίτερα σημαντική για την διαφοροποίηση αλλά και για την μορφογένεση, υδατανθρακική σύσταση των κυτταροπλασματικών μεμβρανών της ανθρώπινης εμβρυϊκής επιδερμίδας, οι μεταβολές της αναλόγως του εξελικτικού σταδίου και οι διαφορές της σε σχέση με την επιδερμίδα του ενηλίκου, είναι ελάχιστα μελετημένες. Οι σχετικές εργασίες που ανευρίσκονται στη διεθνή βιβλιογραφία είναι ελάχιστες σε αριθμό και αποσπασματικές (περιορισμένο υλικό, στενό φάσμα εξεταζόμενων ηλικιών), ενώ τα αποτελέσματα τους είναι σε πολλές περιπτώσεις αντιφατικά. Για τους λόγους αυτούς ο σκοπός της παρούσης εργασίας ήταν η διερεύνηση σε μεγάλο δείγμα και ευρύ ηλικιακό φάσμα της υδατανθρακικής συστάσεως των κυτταροπλασματικών μεμβρανών κατά τη μορφογένεση της ανθρώπινης επιδερμίδας, με τη χρήση έξι διαφορετικών βιοτινυλιωμένων λεκτινών (PNA, DBA, WGA, RCA, ConA και UEA), η αντιπαραβολή των ευρημάτων με τα αντίστοιχα της διεθνούς βιβλιογραφίας και με εκείνα της υγιούς επιδερμίδας του ενηλίκου και τέλος η διερεύνηση του ενδεχομένου μελλοντικής αξιοποιήσεως των ευρημάτων της μελέτης στα πλαίσια διαγνωστικών ή θεραπευτικών εφαρμογών. Το υλικό της παρούσης εργασίας αποτελείτο από 152 συνολικά βιοψίες δέρματος κνήμης, ηλικίας 10 έως 23 εβδομάδων EGA. Ο καθορισμός της ηλικίας, η επεξεργασία των βιοψιών και η χρώση με λεκτίνες έγιναν σύμφωνα με καθιερωμένες μεθόδους που περιγράφονται στο αντίστοιχο κεφάλαιο. Κατά τη χρώση με τη λεκτίνη ΡΝΑ διαπιστώθηκε στο περιδέρμιο και στην ενδιάμεση στιβάδα συνεχής παρουσία της D-γαλακτοζο-β-(1,3)- Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης από την 10η μέχρι και την 20η εβδομάδα. Η βασική στιβάδα ήταν αρνητική σε όλα τα παρασκευάσματα από την 10η έως την 20η εβδομάδα, ενώ παρουσία της D-γαλακτοζο-β-(1,3)-Ν- ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης στην βασική μεμβράνη διαπιστώθηκε από την 10η έως και την 13η εβδομάδα. Στα παρασκευάσματα της 23η εβδομάδας η κεράτινη στιβάδα, η βασική στιβάδα και η βασική μεμβράνη ήταν αρνητικές στην ΡΝΑ, ενώ οι κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων τόσο της κοκκώδους όσο και της ακανθωτής στιβάδας παρουσίαζαν μετρίας εντάσεως θετική χρώση. Η υδατανθρακική σύσταση των κυτταροπλασματικών μεμβρανών στην εμβρυϊκή επιδερμίδα ηλικίας 23ων εβδομάδων και στην επιδερμίδα των ενηλίκων είναι ταυτόσημη. Η RCA έδωσε θετική αντίδραση κυμαινόμενης εντάσεως στο περιδέρμιο και στην ενδιάμεση στιβάδα σε όλα τα παρασκευάσματα από την 10η έως και την 20η εβδομάδα, γεγονός το οποίο υποδηλώνει μεμβρανική παρουσία της β-D-γαλακτόζης. Η β-D-γαλακτόζη ήταν παρούσα σε χαμηλή συγκέντρωση στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων της βασικής στιβάδας μεταξύ 10ης-12ης και 18ης-20ης εβδομάδας, ενώ αντιθέτως δεν ανιχνεύθηκε από την 13η έως την 17η εβδομάδα. Στην βασική μεμβράνη παρουσία της διαπιστώθηκε έως την 15η εβδομάδα. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα της 23ης εβδομάδας η β-D- γαλακτόζη απουσιάζει μόνο στην κεράτινη στιβάδα και στη βασική μεμβράνη, ενώ η συγκέντρωσή της αυξάνει στις μεμβράνες των κυττάρων από την βασική προς την ενδιάμεση στιβάδα. Όσον αφορά και την RCA η χρώση της εμβρυϊκής επιδερμίδος κατά την 23η εβδομάδα αντιστοιχεί σε γενικές γραμμές με εκείνη της επιδερμίδας των ενηλίκων. Το περιδέρμιο ήταν θετικό για την DBA από την 10η έως και την 20η εβδομάδα, εύρημα το οποίο υποδηλώνει παρουσία της α-D-N- ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων του από την 10η εβδομάδα μέχρι και την απόπτωσή του. Ο υδατάνθρακας αυτός απουσίαζε όμως πλήρως στις μεμβράνες των κυττάρων τόσο της ενδιάμεσης όσο και της βασικής στιβάδας από την 10η έως και την 20η εβδομάδα. Η α-D-N-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη ανιχνευόταν στη βασική μεμβράνη μόνον μεταξύ της 10ης και της 12ης εβδομάδας. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα ηλικίας 23ων εβδομάδων ο υδατάνθρακας αυτός απουσίαζε παντελώς στη βασική μεμβράνη και σε όλες τις στιβάδες πλην της βασικής, στην οποία ανιχνευόταν σε ποσοστό 40% των παρασκευασμάτων και μόνον εστιακά. Το παρατηρούμενο πρότυπο γλυκοζυλιώσεως στην 23η εβδομάδα όσον αφορά την α-D-N- ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη, είναι ταυτόσημο με εκείνο που παρατηρείται στην επιδερμίδα των ενηλίκων. Σύμφωνα με πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα πιθανολογείται πως τα DBA-θετικά κύτταρα της βασικής στιβάδας αποτελούν πρώιμα μεταμιτωτικά διαφοροποιούμενα κύτταρα. Για την μετακίνηση των κυττάρων αυτών προς τις υπερβασικές στιβάδες είναι απαραίτητη η απώλεια των β1-ιντεγκρινών από την κυτταρική επιφάνεια, φαινόμενο που σχετίζεται με την διακοπή της γλυκοζυλιώσεως της β1 ιντεγκρινικής υπομονάδας και τη συσσώρευσή της στο σύστημα Golgi. Η παρουσία της α-D-N-ακετυλο-D- γαλακτοζαμίνης θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει σήμα αναστολής της κινήσεως της β1-ιντεγκρίνης προς την κυτταρική επιφάνεια. Η χρώση της εμβρυϊκής επιδερμίδας με ConA στο περιδέρμιο και την ενδιάμεση στιβάδα ήταν θετική μεταξύ 10ης και 20ης εβδομάδος, με συνεχείς διακυμάνσεις της εντάσεως (και κατά συνέπεια της συγκεντρώσεως της α-D-μανόζης και της α-D-γλυκόζης). Στην βασική στιβάδα η ConA ήταν θετική έως και την 12η εβδομάδα, ενώ στην βασική μεμβράνη ήταν θετική έως την και την 14η εβδομάδα. Η παρουσία της α- D-μανόζης και της α-D-γλυκόζης στην βασική στιβάδα σε πρώιμα στάδια της μορφογενέσεως φαίνεται να αποτελεί διαφορά μεταξύ της εμβρυϊκής επιδερμίδας και άλλων εμβρυϊκών επιθηλίων και υποδηλώνει κάποιο ειδικό ρόλο του υδατάνθρακος αυτού κατά το κρίσιμο στάδιο της επιδερμιδικής διαφοροποιήσεως. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα κατά την 23η εβδομάδα η α-D-μανόζη και η α-D-γλυκόζη ανιχνεύονται μόνο στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων της κοκκώδους και της ακανθωτής στιβάδας. Η απουσία τους από τη βασική στιβάδα της εμβρυϊκής επιδερμίδας στις 23 εβδομάδες αποτελεί και τη μοναδική διαφορά της τελευταίας σε σύγκριση με την επιδερμίδα των ενηλίκων. Αν εξαιρέσει κανείς τη βασική στιβάδα της εμβρυϊκής επιδερμίδας (και τη βασική μεμβράνη) από τη 10η έως και την 20η εβδομάδα στην οποία η μεμβρανική χρώση με UEA ήταν αρνητική (άρα απουσίαζε η α- L-φουκόζη) στις υπόλοιπες επιδερμιδικές στιβάδες η ένταση της χρώσεως παρουσίαζε μεγάλες διακυμάνσεις. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα ηλικίας 23ων εβδομάδων θετική χρώση με UEA και επομένως και παρουσία α-L-φουκόζης υπήρχε μόνο στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων της κοκκώδους και της ακανθωτής στιβάδας, όπως ακριβώς συμβαίνει και στην επιδερμίδα του ενηλίκου. Η απουσία της α-L-φουκόζης στη βασική στιβάδα φαίνεται να αποτελεί σημαντική διαφορά μεταξύ της εμβρυϊκής επιδερμίδας και άλλων εμβρυϊκών επιθηλίων όπως π.χ. του αναπνευστικού. Αντιθέτως, η πρώιμη παρουσία της στις μεμβράνες των κυττάρων της ενδιάμεσης στιβάδας, υποδηλώνει σημαντικό ρόλο της κατά τα πρώτα στάδια της επιδερμιδικής διαφοροποιήσεως. Βασικό χαρακτηριστικό γνώρισμα της χρώσεως της εμβρυϊκής επιδερμίδας από την 10η έως και την 20η εβδομάδα με τη λεκτίνη WGA ήταν οι συνεχείς διακυμάνσεις της εντάσεώς της τόσο στο περιδέρμιο όσο και στην ενδιάμεση και στη βασική στιβάδα, ενώ στη βασική μεμβράνη μετά την 13η εβδομάδα η αντίδραση ήταν αρνητική. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν αντίστοιχες ποσοτικές μεταβολές της μεμβρανικής συγκεντρώσεως της β(1,4)-D-N-ακετυλο-D-γλυκοζαμίνης. Στα παρασκευάσματα της 23ης εβδομάδας αρνητική χρώση με WGA παρατηρήθηκε μόνο στην κεράτινη στιβάδα και στη βασική μεμβράνη, όπως ακριβώς και στην επιδερμίδα των ενηλίκων. Σε όλες τις περιπτώσεις μεταξύ 13ης και 15ης εβδομάδος η βασική μεμβράνη αρνητικοποιήθηκε για τους υδατάνθρακες D-γαλακτοζο-β- (1,3)-Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη, β-D-γαλακτόζη, α-D-N-ακετυλο-D- γαλακτοζαμίνη και α-D-μανόζη, α-D-γλυκόζη. Οι αλλαγές αυτές στην γλυκοζυλίωση συμπίπτουν χρονικά με την έναρξη του σταδίου της θυλακικής κερατινοποίησης και πιθανώς να σχετίζονται με την - απαραίτητη για τη μορφογένεση των τριχικών θυλάκων και άλλων δομών - σύνθετη αλληλεπίδραση επιδερμίδας-χορίου. Η ερμηνεία των παρατηρηθέντων μεταβολών της υδατανθρακικής σύστασης των κυτταροπλασματικών μεμβρανών κατά τη μορφογένεση της επιδερμίδας είναι επί του παρόντος δυσχερής, δεδομένου ότι οι μηχανισμοί συνθέσεως και μεταφοράς των υδατανθράκων στα επιδερμιδικά κύτταρα παραμένουν άγνωστοι. Η σύγκριση των ευρημάτων της παρούσης μελέτης με τις ολιγάριθμες και αποσπασματικές προγενέστερες σχετικές εργασίες, δείχνει ταύτηση σε πολλά σημεία αλλά και σημαντικές διαφορές. Για την ερμηνεία των διαφορών αυτών θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ο πολύ μικρός αριθμός παρασκευασμάτων που χρησιμοποιήθηκε στις προγενέστερες εργασίες, ο συγκριτικά πολύ μεγάλος αριθμός παρασκευασμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, οι διαφορές στις θέσεις λήψεως των βιοψιών του δέρματος μεταξύ των μελετών, αλλά και οι διαφορές στις τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν. Τα ευρήματα της παρούσης μελέτης, στην οποία αναλύεται για πρώτη φορά σε τέτοιο βαθμό πληρότητας (ηλικιακό φάσμα, αριθμός παρασκευασμάτων), η υδατανθρακική σύσταση των κυτταροπλασματικών μεμβρανών κατά την μορφογένεση, θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για τη διερεύνηση της παθογένειας δερματικών νοσημάτων, καθώς και για τη μελλοντική ανάπτυξη διαγνωστικών και θεραπευτικών εφαρμογών.