| Summary: | Στο πλαίσιο της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας πραγματοποιήθηκε μελέτη του ζυγωτικά εκφραζόμενου μεταγραφικού παράγοντα Coup-TF και της επίδρασής του στο εμβρυικό νευρικό σύστημα του αχινού Paracentrotus lividus. Προς αυτό το σκοπό επιχειρήθηκε η καταστολή της έκφρασης του ζυγωτικού Coup-TF με δύο διαφορετικά αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια που εμποδίζουν αμφότερα τη διενέργεια ματίσματος (splice-blocking morpholinos) σε εσόνια του πρώιμου μετάγραφου του Coup-TF. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε και καταστολή της έκφρασης του μητρικού Coup-TF με αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια που εμποδίζουν την έναρξη της μετάφρασης του ώριμου mRNA (translation-blocking morpholino). Τα αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια, καθώς και το διάλυμα ελέγχου, εισήχθησαν με μικροένεση σε ωάρια, τα οποία μετά τη γονιμοποίηση αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες. Ενεμένα και μη ενεμένα έμβρυα συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή in situ υβριδοποίησης με τους κατάλληλους ανιχνευτές, ώστε να ελεγχθεί η έκφραση των γονιδίων που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη νευρογένεση του εμβρύου του αχινού. Τα γονίδια που επιλέχθηκαν είναι τα FoxG και Onecut/Hnf6 τα οποία αποτελούν δείκτες της βλεφαριδωτής ζώνης και είναι απαραίτητα για τον καθορισμό της, τα γονίδια FoxQ2 και Six3 που αποτελούν δείκτες του πρόσθιου νευροεξωδέρματος και είναι απαραίτητα για τον καθορισμό του και τα γονίδια Sip1 και SoxC που αποτελούν δείκτες πρόδρομων και προγονικών νευρικών κυττάρων αντίστοιχα. Τα γονίδια που παρουσίασαν αλλαγές στο πρότυπο έκφρασής τους είναι τα FoxG, Hnf6 και Sip1. Πιο συγκεκριμένα η καταστολή του ζυγωτικά εκφραζόμενου Coup-TF οδήγησε σε εκτοπική έκφραση των γονιδίων FoxG και Sip1 και σε καταστολή της έκφρασης του γονιδίου Onecut/Hnf6. Επιπρόσθετα, προκειμένου να πραγματοποιηθεί καταστολή της έκφρασης του γονιδίου Coup-TF μέσω του συστήματος Crispr-Cas9, σχεδιάστηκαν και παρασκευάστηκαν τα αναγκαία υλικά (Cas9 mRNA, gRNAs) που στη συνέχεια χορηγήθηκαν με ένεση σε ωάρια για την μετάλλαξη του γονιδίου Coup-TF.
|
|---|
