Έκφραση και χαρακτηρισμός ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών μεταφοράς χαλκού για τη μελέτη της συνεργικής τους δράσης κατά το τελευταίο στάδιο της αναπνευστικής αλυσίδας του μιτοχονδρίου

• Κύριος συγγραφέας: Γκαζώνης, Πέτρος
• Άλλοι συγγραφείς: Σπυρούλιας, Γεώργιος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2009
• Θέματα: Πρωτεΐνες μεταφοράς χαλκού; Οξειδάση του κυτοχρώματος c; Μιτοχόνδριο; 572.7; Copper chaperones; Cytochrome c oxidase; Sco; Hypothetical protein; Mitochondrion; tt1943

Ο ρόλος του χαλκού είναι πολύ σημαντικός για τη σωστή λειτουργία της κυτοχρωμικής c οξειδάσης (CcO), και συνεπώς για την κυτταρική αναπνοή στους ευκαρυωτικούς και προκαρυωτικούς οργανισμούς. Η συγκρότηση της CcO στον ενδομεμβρανικό μιτοχονδριακό χώρο είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, εξαρτώμενη από πλήθος συνεργών πρωτεϊνών, υπεύθυνων για τη λειτουργική αναδίπλωση των υπομονάδων του ενζύμου και τη μεταφορά αίμης και ιόντων Cu σε αυτές. Ενώ οι πρωτεΐνες που ενέχονται στη διαδικασία είναι μάλλον γνωστές, οι μηχανισμοί μεταφοράς και ενσωμάτωσης των μεταλλικών ιόντων στα δυο ενεργά κέντρα της CcO, CuA και CuB, παραμένουν ανεξερεύνητοι. Το CuA κέντρο είναι ένα διπυρηνικό κέντρο χαλκού, του οποίου ο ρόλος εντοπίζεται στη μεταφορά e- από το κυτόχρωμα c στο καταλυτικό κέντρο CuB της CcO. Η σωστή συγκρότηση του CuA κέντρου είναι κρίσιμης σημασίας για την καταλυτική δράση του ενζύμου. Αρκετές πρωτεΐνες έχουν χαρακτηριστεί σαν ενεργοί παράγοντες στη μεταφορά ιόντων Cu στο CuA κέντρο, ο ακριβής, ωστόσο, μοριακός μηχανισμός και ρόλος της κάθε πρωτεΐνης είναι άγνωστος. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς, δυο οικογένειες πρωτεϊνών έχουν προταθεί για την εμπλοκή τους στη συγκρότηση του CuA. Η πρώτη περιλαμβάνει πρωτεΐνες που δεσμεύουν ιόντα Cu1+ με ένα συντηρημένο μοτίβο δέσμευσης H(M)x10Mx21HxM (υποθετικές πρωτεΐνες Hyp1) ενώ η δεύτερη περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες της οικογένειας Sco, των οποίων ο ρόλος στον μηχανισμό του CuA κέντρου σαν θειορεδοξίνες ή χαλκομεταφορείς, παραμένει ασαφής. Στην παρούσα εργασία αποδείχθηκε ότι μια νέα περιπλασματική πρωτεΐνη (TtHyp1 ή PCuAC) εισάγει επιλεκτικά ιόντα Cu1+ στην Cox2 υπομονάδα της ba3-CcO του Thermus thermophilus προς σχηματισμό του φυσιολογικού διπυρηνικού TtCuA κέντρου, καθώς και ότι η Sco πρωτεΐνη του συγκεκριμένου οργανισμού (TtSco1) δεν μεταφέρει μεταλλικά ιόντα στο CuA, αλλά δρα σαν θειο-δισουλφιδική αναγωγάση ρυθμίζοντας τη σωστή οξειδωτική κατάσταση των κυστεϊνικών καταλοίπων του CuA. Οι πρωτεΐνες PCuAC, TtSco1 και TtCuA εκφράστηκαν, απομονώθηκαν και μελετήθηκαν τα βιοχημικά χαρακτηριστικά τους, η ικανότητα δέσμευσης μεταλλικών ιόντων και οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Επιπλέον η PCuAC χαρακτηρίστηκε δομικά με φασματοσκοπία NMR στην απο και Cu(I) μορφή της. Ο ρόλος των προκαρυωτικών Sco διερευνήθηκε περαιτέρω με μελέτες γονιδιακής ανάλυσης και την έκφραση και τον προκαταρκτικό χαρακτηρισμό μιας νέας πρωτεΐνης, PpSco1/cytc της Pseudomonas putida, πρωτεΐνης αποτελούμενης από δυο επικράτειες, Sco1 και cytc, συνδέοντας το ρόλο των Sco πρωτεϊνών με τη θεωρια περί θειρεδοξινικής τους δράσης. Καινοτομία στην παρούσα εργασία αποτέλεσε η μεθοδολογική προσέγγιση της πολλαπλής κλωνοποίησης των γονιδίων-στόχων με μια νέα τεχνολογία κλωνοποίησης (Gateway) συνδυασμένης με τοποειδική ένθεση σε πολλαπλούς πλασμιδιακούς φορείς και η ανάπτυξη high throughput τεχνικών για πολλαπλές δοκιμές έκφρασης – απομόνωσης. Η συγκεκριμένη μελέτη παρέχει νέα δεδομένα για το μηχανισμό τη συγκρότησης του CuA κέντρου της προκαρυωτικής CcO, υποστηρίζοντας ένα νέο μοντέλο για τη συγκεκριμένη διαδικασία και παράλληλα συνδράμει στην αποκρυπτογράφηση του πολύπλοκου ρόλου των Sco πρωτεϊνών.