Ανάπτυξη επισωματικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς που βασίζονται σε χρωμοσωματικά στοιχεία του ανθρώπου
Η γονιδιακή θεραπεία αποτελεί μια θεραπευτική παρέμβαση στην οποία το φάρμακο είναι DNA ή RNA (διαγονίδιο) και υπόσχεται ίαση σε μια σειρά μονογονιδιακών ασθενειών και κακοηθειών. Η γονιδιακή μεταφορά του επιθυμητού διαγονιδίου επιτυγχάνεται με την χρήση φορέων κυρίως ιϊκών που καλούνται να υπερκερ...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Μορφή: | Thesis |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2020
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/13258 |
| id |
nemertes-10889-13258 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Μη ιϊκοί φορείς Β-σφαιρίνη S/MAR Non viral vectors B-globin 615.895 |
| spellingShingle |
Μη ιϊκοί φορείς Β-σφαιρίνη S/MAR Non viral vectors B-globin 615.895 Λάζαρης, Βασίλειος Ανάπτυξη επισωματικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς που βασίζονται σε χρωμοσωματικά στοιχεία του ανθρώπου |
| description |
Η γονιδιακή θεραπεία αποτελεί μια θεραπευτική παρέμβαση στην οποία το φάρμακο είναι DNA ή RNA (διαγονίδιο) και υπόσχεται ίαση σε μια σειρά μονογονιδιακών ασθενειών και κακοηθειών. Η γονιδιακή μεταφορά του επιθυμητού διαγονιδίου επιτυγχάνεται με την χρήση φορέων κυρίως ιϊκών που καλούνται να υπερκεράσουν τους φυσικούς φραγμούς και να καθοδηγήσουν το γονίδιο στο πυρήνα του κυττάρου. Οι επισωματικοί φορείς αποτελούν μια εναλλακτική προσέγγιση στους ήδη καθιερωμένους ιϊκούς φορείς κυρίως στο ότι δεν ενσωματώνονται στο DNA των κυττάρων. Οι φορείς αυτοί τελευταία στηρίζονται στην ύπαρξη μιας χρωμοσωμικής αλληλουχίας που ονομάζεται S/MAR (scaffold/ matrix attachment region) για την συγκράτηση τους στον πυρήνα του κυττάρου. Περαιτέρω, ο συνδυασμός της αλληλουχίας S/MAR με ένα ακόμα χρωμοσωμικό στοιχείο το IR (Initiation of replication) φαίνεται να βελτιώνει τις ιδιότητες του φορέα σε κυτταρικές σειρές και σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Στην παρούσα διατριβή δημιουργήσαμε ένα νέο φορέα (pEPI-IR/β-globin) ο οποίος φέρει ως διαγονίδιο το γονίδιο της β-σφαιρίνης της αιμοσφαιρίνης του ανθρώπου, τις ρυθμιστικές αλληλουχίες αυτού αλλά και τις δύο χρωμοσωμικές αλληλουχίες S/MAR και IR. Mελετήσαμε την λειτουργικότητα του φορέα αυτού και προσδιορίστηκε ότι ο φορέας pEPI-IR/β-globin μπορεί να διαμολύνει επιτυχώς κύτταρα της αιματολογικής κυτταρικής σειράς Κ562 με την διαδικασία της nucleofection. Είναι σε θέση να εγκαταστήσει σταθερή διαμόλυνση στα κύτταρα αυτά και να ανιχνεύεται μετά από τουλάχιστον 100 γενεές (σε 1,3 αντίγραφα ανά κύτταρο), ενώ κατά το διάστημα αυτό διατηρεί την επισωματική του κατάσταση. Διατηρείται η λειτουργικότητα της κασέτας του γονιδίου της β-σφαιρίνης και η έκφραση του ανιχνεύεται τόσο σε επίπεδο mRNA με real-time PCR όσο και σε επίπεδο πεπτιδίου με ανοσοφθορισμό in situ. Συμπερασματικά ο pEPI-IR/β-globin αποτελεί έναν νέο επισωματικό φορέα ο οποίος είναι λειτουργικός σε κύτταρα Κ562 και μπορεί να αποτελέσει την βάση ανάπτυξης επισωματικών φορέων της β-σφαιρίνης για περαιτέρω πειράματα για τους σκοπούς της γονιδιακής θεραπείας θαλασσαιμικών συνδρόμων. |
| author2 |
Σπυριδωνίδης, Αλέξανδρος |
| author_facet |
Σπυριδωνίδης, Αλέξανδρος Λάζαρης, Βασίλειος |
| format |
Thesis |
| author |
Λάζαρης, Βασίλειος |
| author_sort |
Λάζαρης, Βασίλειος |
| title |
Ανάπτυξη επισωματικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς που βασίζονται σε χρωμοσωματικά στοιχεία του ανθρώπου |
| title_short |
Ανάπτυξη επισωματικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς που βασίζονται σε χρωμοσωματικά στοιχεία του ανθρώπου |
| title_full |
Ανάπτυξη επισωματικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς που βασίζονται σε χρωμοσωματικά στοιχεία του ανθρώπου |
| title_fullStr |
Ανάπτυξη επισωματικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς που βασίζονται σε χρωμοσωματικά στοιχεία του ανθρώπου |
| title_full_unstemmed |
Ανάπτυξη επισωματικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς που βασίζονται σε χρωμοσωματικά στοιχεία του ανθρώπου |
| title_sort |
ανάπτυξη επισωματικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς που βασίζονται σε χρωμοσωματικά στοιχεία του ανθρώπου |
| publishDate |
2020 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/13258 |
| work_keys_str_mv |
AT lazarēsbasileios anaptyxēepisōmatikōnphoreōngonidiakēsmetaphoraspoubasizontaisechrōmosōmatikastoicheiatouanthrōpou AT lazarēsbasileios developmentofepisomalvectorsforgenetransferbasedonhumanchromosomalelements |
| _version_ |
1771297291303387136 |
| spelling |
nemertes-10889-132582022-09-05T20:29:47Z Ανάπτυξη επισωματικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς που βασίζονται σε χρωμοσωματικά στοιχεία του ανθρώπου Development of episomal vectors for gene transfer, based on human chromosomal elements Λάζαρης, Βασίλειος Σπυριδωνίδης, Αλέξανδρος Αθανασιάδου, Αγλαΐα Μοσχονάς, Νικόλαος Βασιλόπουλος, Γεώργιος Δραΐνας, Διονύσιος Παπαχατζοπούλου, Αδαμαντία Σγουρού, Αργυρώ Lazaris, Vasileios Μη ιϊκοί φορείς Β-σφαιρίνη S/MAR Non viral vectors B-globin 615.895 Η γονιδιακή θεραπεία αποτελεί μια θεραπευτική παρέμβαση στην οποία το φάρμακο είναι DNA ή RNA (διαγονίδιο) και υπόσχεται ίαση σε μια σειρά μονογονιδιακών ασθενειών και κακοηθειών. Η γονιδιακή μεταφορά του επιθυμητού διαγονιδίου επιτυγχάνεται με την χρήση φορέων κυρίως ιϊκών που καλούνται να υπερκεράσουν τους φυσικούς φραγμούς και να καθοδηγήσουν το γονίδιο στο πυρήνα του κυττάρου. Οι επισωματικοί φορείς αποτελούν μια εναλλακτική προσέγγιση στους ήδη καθιερωμένους ιϊκούς φορείς κυρίως στο ότι δεν ενσωματώνονται στο DNA των κυττάρων. Οι φορείς αυτοί τελευταία στηρίζονται στην ύπαρξη μιας χρωμοσωμικής αλληλουχίας που ονομάζεται S/MAR (scaffold/ matrix attachment region) για την συγκράτηση τους στον πυρήνα του κυττάρου. Περαιτέρω, ο συνδυασμός της αλληλουχίας S/MAR με ένα ακόμα χρωμοσωμικό στοιχείο το IR (Initiation of replication) φαίνεται να βελτιώνει τις ιδιότητες του φορέα σε κυτταρικές σειρές και σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Στην παρούσα διατριβή δημιουργήσαμε ένα νέο φορέα (pEPI-IR/β-globin) ο οποίος φέρει ως διαγονίδιο το γονίδιο της β-σφαιρίνης της αιμοσφαιρίνης του ανθρώπου, τις ρυθμιστικές αλληλουχίες αυτού αλλά και τις δύο χρωμοσωμικές αλληλουχίες S/MAR και IR. Mελετήσαμε την λειτουργικότητα του φορέα αυτού και προσδιορίστηκε ότι ο φορέας pEPI-IR/β-globin μπορεί να διαμολύνει επιτυχώς κύτταρα της αιματολογικής κυτταρικής σειράς Κ562 με την διαδικασία της nucleofection. Είναι σε θέση να εγκαταστήσει σταθερή διαμόλυνση στα κύτταρα αυτά και να ανιχνεύεται μετά από τουλάχιστον 100 γενεές (σε 1,3 αντίγραφα ανά κύτταρο), ενώ κατά το διάστημα αυτό διατηρεί την επισωματική του κατάσταση. Διατηρείται η λειτουργικότητα της κασέτας του γονιδίου της β-σφαιρίνης και η έκφραση του ανιχνεύεται τόσο σε επίπεδο mRNA με real-time PCR όσο και σε επίπεδο πεπτιδίου με ανοσοφθορισμό in situ. Συμπερασματικά ο pEPI-IR/β-globin αποτελεί έναν νέο επισωματικό φορέα ο οποίος είναι λειτουργικός σε κύτταρα Κ562 και μπορεί να αποτελέσει την βάση ανάπτυξης επισωματικών φορέων της β-σφαιρίνης για περαιτέρω πειράματα για τους σκοπούς της γονιδιακής θεραπείας θαλασσαιμικών συνδρόμων. Gene therapy is a therapeutic intervention in which the drug is DNA or RNA (transgene) and promises to cure a series of monogenic diseases and malignancies. The gene transfer of the desired transgene is accomplished using predominantly viral vectors urged to overcome natural barriers and "deliver" the gene to the cell nucleus. Episomal vectors represent an alternative approach to already established viral vectors, notably that they are not integrated into the DNA of the cells. These vectors are currently based on the existence of a chromosomal sequence called S/MAR (scaffold / matrix attachment region) for their retention in the cell nucleus. Further, the combination of the S/MAR sequence with another chromosomal element called IR (Initiation of replication) seems to improve the properties of the vector in cell lines and in primary hematopoietic cells. In the present thesis, we have created a new vector (pEPI-IR/β-globin) which carries the human β-globin gene as its transgene, its regulatory sequences but also the two S/MAR and IR chromosomal sequences. We studied the functionality of this vector and it was determined that the pEPI-IR / β-globin vector can successfully transfect cells of the K562 hematologic cell line by the nucleofection method. The vector can establish stable transfection in K562 cells and be detected after at least 100 generations (at 1.3 copies per cell), while maintaining episomal status. The functionality of the β-globin gene cassette is maintained, and its expression is detected in both mRNA level by real-time PCR and peptide level by in situ immunofluorescence. In conclusion, pEPI-IR / β-globin is a new episomal vector that is functional in K562 cells and may be the basis for the development of β-globin episomal vectors for further experiments for gene therapy of thalassemic syndromes. 2020-03-03T22:59:09Z 2020-03-03T22:59:09Z 2018-12-15 Thesis http://hdl.handle.net/10889/13258 gr 12 application/pdf |
