| Περίληψη: | Με σκοπό να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς επαγωγής
απόπτωσης από την TRAIL και την επιλεκτικότητα την οποία δείχνει
απέναντι στα καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές,
προερχόμενες από το παχύ έντερο ανθρώπου, οι οποίες αντιπροσωπεύουν
τα διάφορα στάδια της καρκινογένεσης, από το πρώιμο αδένωμα στο
καρκίνωμα. Παρατηρήθηκε μια ανθεκτικότητα των πρώιμων αδενωμάτων
απέναντι στην TRAIL σε αντίθεση με τα κύτταρα που προέρχονται από
καρκίνους προχωρημένου σταδίου, ενώ σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζει,
εκτός από το στάδιο καρκινογένεσης και η ύπαρξη ορισμένων ογκογονιδίων
στον καθορισμό της ευαισθησίας των κυττάρων απέναντι στην TRAIL.
Συγκεκριμένα, οι διάφορες ισομορφές του ογκογονιδίου RAS παίζουν
ιδιαίτερο ρόλο τόσο όσο αφορά την ανταπόκριση του κύτταρου στην
επαγωγή με TRAIL, όσο και στη ρύθμιση των μορίων που εμπλέκονται
άμεσα στο μονοπάτι σηματοδότησης του TRAIL. Τα ογκογονίδια RAS
παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινική εξαλλαγή ενεργοποιώντας μια σειρά
από μονοπάτια σηματοδότησης που οδηγούν στην ανεξέλεγκτη κυτταρική
διαίρεση και στην προστασία από τα αποπτωτικά σήματα. Εντούτοις, η
TRAIL (Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand) έχει τη
δυνατότητα να προκαλεί απόπτωση κυρίως στα καρκινικά κύτταρα,
ενεργοποιώντας τους υποδοχείς DR4 και DR5 (Death Receptors). Σε αυτή
τη μελέτη δείξαμε ότι σε αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου ανθρώπου
η έκφραση των υποδοχέων της TRAIL ρυθμίζεται από την ενεργότητα της
κινάσης MEK (MAPK/ERK Kinase).
Η ευαισθησία στην TRAIL των κυτταρικών σειρών που
χρησιμοποιήσαμε φάνηκε να συσχετίζεται με το βαθμό κακοήθους
εξαλλαγής. Συγκεκριμένα, οι κυτταρικές σειρές AAC1 και RGC2, που
προέρχονται απο πρώιμα αδενώματα και η κυτταρική σειρά Caco2, που
προέρχεται απο μέσο αδένωμα παρουσίασαν μεγάλη ανθεκτικότητα στην
TRAIL. Αντίθετα, οι κυτταρικές σειρές DLD-1 και HT-29, που προέρχονται
απο αδενοκαρκινώματα προχωρημένου στάδιου ήταν ευαίσθητες στην
TRAIL. Επιλέχθηκε η κυτταρική σειρά Caco2 η οποία είναι ανθεκτική στην
TRAIL και οι δύο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από προχωρημένα αδενοκαρκινώματα για να εξεταστεί η έκφραση σημαντικών μορίων για την
αποπτωτική σηματοδότηση από την TRAIL. Φάνηκε μια αντιστοιχία της
έκφρασης των υποδοχέων DR4 και DR5 με την ευαισθησία των κυττάρων
στην TRAIL, ενώ τα επίπεδα έκφρασης των FADD, κασπάση 8, κασπάση 3
και FLIP δεν παρουσίασαν παρόμοια αντιστοιχία. Επιπλέον, παρατηρήθηκε
παρατεταμένη ενεργοποίηση των κινασών MEK, ERK, JNK1/2 και p38 μετά
από επαγωγή με TRAIL, σε αντίθεση με την αντίστοιχη κινητική
ενεργοποίησης των ίδιων κινασών μετά από επαγωγή με ορό. Αντίστοιχη
κινητική με αυτή των ΜΕΚ και ERK παρουσίασε η έκφραση του γονιδίου c-
FOS μετά από επαγωγή με TRAIL ή ορό. Τα κύτταρα Caco2, DLD-1 και HT-
29 επωάστηκαν με χημικούς αναστολείς των κινασών ΜΕΚ για 16 h και
ελέγχθηκε η έκφραση των DR4 και DR5. Τα επίπεδα των DR4 και DR5
μειώθηκαν και στις τρεις κυτταρικές σειρές ως συνέπεια της αναστολής της
ΜΕΚ, ενώ η αναστολή των ΜΕΚ δεν επιρρέασε τα επίπεδα των FADD, FLIP,
κασπάση 8, κασπάση 3 και τον υποδοχέα FAS που ανήκει στην ίδια
οικογένεια με τους DR4 και DR5. Επιπλέον, ελέγχθηκε με ανάλυση FACS η
έκφραση των υποδοχέων DR4, DR5 και FAS in vivo σε ζωντανά κύτταρα
που προεπωάστηκαν με τον αναστολέα της ΜΕΚ και στους αντίστοιχους
μάρτυρες και τα αποτελέσματα ήταν αντίστοιχα με αυτά των in vitro
πειραμάτων. Οι παραπάνω παρατηρήσεις αποτελούν ισχυρές ενδείξεις για
το συσχετισμό της ενεργοποίησης της οδού MEK/ERK/FOS με με την
έκφραση των υποδοχέων DR4 και DR5 και με την ευαισθησία των κυττάρων
στην TRAIL, καθώς κύτταρα HT-29 που προεπωάστηκαν με τον αναστολέα
των ΜΕΚ παρουσίσαν μειωμένη ευαισθησία στην TRAIL.
Για τον προσδιορισμό των διακριτών επιδράσεων των ογκογονιδίων
RAS στον καρκίνο του παχέος εντέρου, διαμολύνθηκαν κύτταρα που
προέρχονται από μέσο αδένωμα του παχέος εντέρου (Caco2) με τα
ογκογονίδια Ki- και Ha-RAS. Μετά από εξέταση πολλών διαφορετικών
κλώνων επιλέχθηκαν για λεπτομερέστερη ανάλυση κλώνοι οι οποίοι δεν
υπερεκφράζουν την RAS σε πρωτεϊνικό επίπεδο πάνω από 3 φορές σε
σχέση με την ενδογενή RAS των μητρικών κυττάρων. Επιπλέον, ελέγχθηκε
αν οι κλώνοι που υπερεκφράζουν τις ογκογόνες RAS παρουσιάζουν
αυξημένη σηματοδότηση προς μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης που
είναι γνωστό οτι ενεργοποιούνται από τις RAS. Τόσο οι κλώνοι Ki-RAS, όσο
και οι Ha-RAS, έδειξαν να ενεργοποιούν τα μονοπάτια σηματοδότησης RAF/MEK/ERK και PI3K/AKT με τους Ha-RAS να προκαλούν ισχυρότερη
ενεργοποίηση.
Σχεδιάστηκαν πειράματα για τον καθορισμό του βαθμού της in vitro
και in vivo κακοήθους εξαλλαγής. Τα πειράματα σε μαλακό άγαρ δείχνουν
την αποτελεσματικότητα των καρκινικών κυττάρων να αναπτύσσονται
δημιουργώντας αποικίες χωρίς να προσκολλώνται σε επιφάνεια. Οι δυο
ισομορφές της RAS αύξησαν σημαντικά την ιδιότητα των Caco2 να
σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ, ενώ η Ha-RAS παρουσίασε τη
μεγαλύτερη ικανότητα. Για τον προσδιορισμό του βαθμού κακοήθους
εξαλλαγής των κλώνων in vivo έγινε υποδόριος εμβολιασμός με περίπου 106
κύτταρα από τον κάθε κλώνο σε ποντίκια SCID. Τόσο η Κi-RASV12 όσο και
η Ha-RASV12 αύξησαν την ικανότητα των Caco2 να σχηματίζουν όγκους σε
ποντίκια SCID με την Ha-RAS να προκαλεί τον σχηματισμό περισσότερων
και μεγαλύτερων όγκων. Για την περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών
εξαλλαγής των κυττάρων από τα ογκογονίδια RAS αξιολογήθηκαν
αποτελέσματα από ανάλυση γονιδιακών μικροσυστοιχιών. Μετά από
ανάλυση του γονιδιακού προφίλ των CACO-RAS κλώνων και τα δυο
ογκογονίδια βρέθηκαν να επάγουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται
στην αγγειογένεση και στην προώθηση του καρκίνου, όπως τα γονίδια που
κωδικοποιούν τους υποδοχείς VEGF και TGFβ. Σημειώνεται ότι μεταστατικοί
δείκτες, όπως η Vimentin, που είναι και δείκτης της μετάβασης από
επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο, βρέθηκαν να υπερεκφράζονται
μόνο στους κλώνους Ha-RASV12. Ο in vitro και in vivo χαρακτηρισμός
εξαλλαγμένων κυττάρων από τα ογκογονίδια RAS, καθώς και η ανάλυση
μικροσυστοιχειών γονιδίων έδειξε ότι στο κυτταρικό μοντέλο που
χρησιμοποιήθηκε το ογκογονίδιο Ha-RAS έχει αυξημένες εξαλλακτικές
ιδιότητες.
Τα ογκογονίδια RAS αύξησαν το βαθμό κακοήθους εξαλλαγής των
κυττάρων Caco2 και ελέγχθηκε αν αυτό συνοδεύεται από αυξημένη
ευαισθησία των κλώνων CACO2-RAS στην TRAIL. Μετρήθηκε η
βιωσημότητα των κλώνων CACO2-RAS μετά από επαγώγη με TRAIL και
φάνηκε ότι και τα δύο ογκογονίδια αύξησαν την ανταποκρισιμότητα των
κυττάρων Caco2 στην TRAIL. Τα Caco2 που εξαλλάχθηκαν με την Ki-
RASV12 ήταν λιγότερο ευαίσθητα στην TRAIL από ότι αυτά με τη Ha-
RASV12 σε όλους τους κλώνους που ελέγχθηκαν. Ο έλεγχος της έκφρασης σημαντικών παραγόντων για την απόπτωση από την TRAIL έδειξε ότι οι
πρωτεΐνες που παρουσίασαν τις μεγαλύτερες διαφοροποιήσεις στους
κλώνους που υπερεκφράζουν τις RAS, σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρα,
ήταν οι υποδοχείς DR4 και DR5. Παρόλο που οι κλώνοι Ha-RAS
παρουσίασαν μεγαλύτερη ευαισθησία στην TRAIL, τα επίπεδα έκφρασης
των DR4 και DR5 ήταν παρόμοια μεταξύ των κλώνων Ki-RAS και Ha-RAS.
Για να ελεγχθεί κατά πόσο το μονοπάτι σηματοδότησης MEK/ERK παίζει
ρόλο στην υπερέκφραση των υποδοχέων από τα ογκογονίδια RAS
χρησιμοποιήθηκαν χημικοί αναστολείς της ΜΕΚ και ελέγθηκε η επίδρασή
τους στα επίπεδα των DR4 και DR5. H χημική αναστολή της ΜΕΚ
προκάλεσε μείωση των επιπέδων των φωσφορυλιωμένων ERK1/2 και των
επιπέδων έκφρασης των DR4 και DR5 τόσο στους CACO-Κ15, όσο και
στους CACO-Η2. Τέλος, ελέγχθηκε κατά πόσο η μείωση των DR4 και DR5
από την χημική αναστολή των ΜΕΚ μπορέι να έχει επίδραση στη δράση της
TRAIL απέναντι στους κλώνους CACO2-RAS και βρέθηκε ότι προεπώση
των Ha-RASV12 κλώνων για 16 h με χημικό αναστολέα των ΜΕΚ μέιωσε σημαντικά την ευαισθησία τους στην TRAIL.
|
|---|
