Παρασκευή, απομόνωση, χαρακτηρισμός και αλληλεπίδραση με RNA της πρωτεΐνης La μέσω φασματοσκοπίας NMR

• Κύριος συγγραφέας: Αργυρίου, Αικατερίνη
• Άλλοι συγγραφείς: Σπυρούλιας, Γεώργιος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2020
• Θέματα: Πρωτεΐνη La; Υπεροικογένεια LARP; Μοτίβο La; Μοτίβο αναγνώρισης RNA; Αλληλεπίδραση με RNA; Πρόδρομο μόριο tRNA; Ωρίμανση RNA; La protein; LARP; La motif; RRM; RNA binding; pre-tRNA; RNA biogenesis; 572.88

Η πρωτεΐνη La είναι μία πυρηνική πρωτεΐνη που περιγράφηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο ως αυτο-αντιγόνο σε ασθενείς που έπασχαν από Ερυθυματώδη Λύκο (Systemic Lupus Erythematosus) και σύνδρομο Sjögren. Αποτελεί την πρώτη πρωτεΐνη της υπεροικογένειας των LARP που περιγράφηκε. Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού, καθώς σχηματίζει ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα μεποικιλία διαφορετικών μορίων RNA. Βασικός ρόλος της πρωτεΐνης La είναι η προστασία του UUU-3 ́-OH άκρου των μεταγράφων της RNAP III, όπως των pre-tRNA κατά τη διάρκεια της βιογένεσής τους και η σωστή αναδίπλωσή τους στο χώρο. Η πρωτεΐνη La είναι συντηρημένη σε διάφορους οργανισμούς και εμφανίζει κοινή οργάνωση των επικρατειών. Το Ν-τελικό άκρο αποτελείται από τις επικράτειες LaM και RRM1, ενώ το C-τελικό της άκρο ποικίλει σε μέγεθος και αλληλουχία. Το C- τελικό άκρο της ανθρώπινης πρωτεΐνης La και της πρωτεΐνης La του οργανισμού Dictyostelium discoideum περιλαμβάνει ένα δεύτερο μοτίβο RRM, το RRM2α και μια ευκίνητη περιοχή στο C-τελικό άκρο. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται ο σχεδιασμός, η έκφραση και η απομόνωση των επιμέρους επικρατειών και μεγαλύτερων πολυπεπτιδίων που περιλαμβάνουν τον συνδυασμό των επικρατειών αυτών της πρωτεΐνης La του Dictyostelium discoideum και της ανθρώπινης πρωτεΐνης La, ώστε να πραγματοποιηθεί η δομική και η λειτουργική τους μελέτη μέσω της Φασματοσκοπίας NMR. Η επικράτεια LaM εμφανίζει τα κλασικά δομικά στοιχεία των μοτίβων αυτών, ενώ οι επικράτειες RRM1 και RRM2α του Dictyostelium discoideum εμφανίζουν την κλασική δομή των μοτίβων RRM με την προσθήκη μίας έλικας στο C-τελικό και των δύο RRM. Η δομική μελέτη μέσω της Φασματοσκοπίας NMR του πολυπεπτιδίου RRM1-RRM2α πραγματοποιείται με εφαρμογή της τεχνικής της τμηματικής επισήμανσης, εξαιτίας του μεγάλου μεγέθους του πολυπεπτιδίου. Η τεχνική αυτή εφαρμόζεται σε μεγάλες πρωτεΐνες που αποτελούνται από διακριτές επικράτειες, καθώς είναι δυνατή η επισήμανση μίας επικράτειας της πρωτεΐνης παρουσία και των υπολοίπων μη- επισημασμένων επικρατειών. Ακολούθησε η χαρτογράφηση των περιοχών των επιμέρους επικρατειών και των συνδυασμών τους που υφίστανται αλλαγές μετά την προσθήκη του φυσιολογικού υποστρώματος (pre-tRNA Arg ) και ενός συνθετικού δεκαμερούς ολιγονουκλεοτιδίου αποτελούμενο από δέκα ουριδίλια (polyU).