Επίδραση του TGF-β1 και IGF-I στην παραγωγή συστατικών του εξωκυττάριου χώρου από ινοβλάστες πτερυγίου οφθαλμού ανθρώπου

• Κύριος συγγραφέας: Χριστοπούλου, Μαρία Ελπίδα
• Άλλοι συγγραφείς: Αλετράς, Αλέξιος
• Μορφή: Thesis
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2020
• Θέματα: Πτερύγιο; Αυξητικός παράγοντας; Υπεριώδης ακτινοβολία; Ίνωση; Πρωτεάσομα; Ανταγωνισμός; Pterygium; UV; IGF-I; TGF-β1; IL-1β; Antagonism; ROS; MMP-1; 617.719

Το πτερύγιο είναι μία καλοήθης μη φυσιολογική ανάπτυξη του ιστού του επιπεφυκότα, επάνω στη επιφάνεια του κερατοειδή. Έχει τριγωνικό σχήμα και παρουσιάζεται συνήθως στην έσω γωνία του ματιού και όπως και ο επιπεφυκότα έχει αιμοφόρα αγγεία. Αναπτύσσεται αργά και όταν μεγαλώσει, εκτός από αντιαισθητικό, μπορεί να δημιουργήσει και προβλήματα στην όραση, εμποδίζοντάς την ή προκαλώντας αστιγματισμό. Η αιτία που δημιουργεί το πτερύγιο δεν είναι γνωστή. Επειδή όμως εμφανίζεται συχνότερα σε άτομα που εκτίθενται για πολλές ώρες στον ήλιο, στη σκόνη και την ξηρασία (αγρότες, ψαράδες, εργάτες κ.ά.), οι παράγοντες αυτοί θεωρούνται βασικές αιτίες, με βασικότερη, την χρόνια έκθεση στην στη UV ακτινοβολία. Τα παραπάνω οδήγησαν στην ανάπτυξη ενός θεωρητικού μοντέλου σχηματισμού του πτερυγίου στο οποίο η UV ακτινοβολία παίζει πρωταγωνιστικό ρόλο. Πιο συγκεκριμένα η UV ακτινοβολία αποτελεί το εναρκτήριο έναυσμα ενεργοποίησης των κυττάρων του στρώματος ώστε να παράγουν κυτταροκίνες (όπως η IL-6) και αυξητικούς παράγοντες που με την σειρά τους θα οδηγήσουν σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αγγειογέννεση, φλεγμονή και απόπτωση. Ακόμη οι κυτταροκίνες από την μια επάγουν και την έκφραση των MMPs και των αναστολέων τους TIMPs οδηγώντας σε ελάστωση και καταστροφή του ιστού. Από την άλλη επάγουν την απόπτωση, την κυτταρική μετανάστευση και διήθηση με αποτέλεσμα την αποδιάταξη της μεμβράνης Bowman; οδηγώντας τελικά στον σχηματισμό του πτερυγίου. Οι κυτταροκίνες για τις οποίες μιλάμε είναι η IL-6 αλλά και η IL-8, των οποίων η έκφραση έχει βρεθεί σε αυξημένα επίπεδα σε ιστούς πτερυγίου. Από την βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι η IL-6 παίζει σπουδαίο ρόλο στους παθογενετικούς μηχανισμούς της ίνωσης και της φλεγμονώδους διαδικασίας. Παράγεται κυρίως από κύτταρα όπως διεγερμένα μακροφάγα, ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά μαζί με τα επιθηλιακά, τα ηωσινόφιλα και τα σιτευτικά χαρακτηρίζουν την παθομορφολογία του πτερυγίου. Εκτός από τις κυτταροκίνες σε όλη την διαδικασία της ίνωσης εμπλέκονται και αυξητικοί παράγοντες όπως ο TGF-b1 και ο IGF-1. Ο TGFβ1 είναι μία πολυλειτουργική κυτταροκίνη, που εκκρίνεται από πολλούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων, ενώ έχει αναφερθεί στο επιχείλιο στρώμα του ανθρώπινου κερατοειδή. Ακόμη, θεωρείται ένας αντιφλεγμονώδης αυξητικός παράγοντας που εν γένει παίζει προστατευτικό ρόλο σε ασθένειες που συνδέονται με αποικοδόμηση των συστατικών του εξωκυτταρικού χώρου, όπως οι αρθρίτιδες, αλλά παθογενετικό σε ασθένειες που συνδέονται με συσσώρευση της εξωκυττάριας ύλης, όπως οι ινώσεις. Μεταξύ άλλων, επάγει την έκφραση του κολλαγόνου και του ΤΙΜΡ-1, ενώ είναι γνωστό ότι ανταγωνίζεται τη διεγερτική δράση της IL-1β στην έκφραση διαφόρων βιοδραστικών μορίων, όπως της MMP-1 σε ινοβλάστες δέρματος και των μορίων συγκόλλησης σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο αυξητικός παράγοντας τύπου ινσουλίνης Ι (IGF-I) είναι μια πρωτεΐνική ορμόνη και ανήκει στην ίδια οικογένεια με την ινσουλίνη. Εκκινεί πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια που έχουν ως αποτέλεσμα την επαγωγή ή την καταστολή γονιδίων σχετικών με τον κυτταρικό κύκλο, την αύξηση και την απόπτωση. Οι βιολογικές του δράσεις καθορίζονται από την απελευθέρωση του από τις IGF-BPs των οποίων η έκφραση έχει αναφερθεί αυξημένη στο πτερύγιο. Κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες ρυθμίζουν την έκφραση των MMPs δρώντας διεγερτικά ή κατασταλτικά στην έκφραση αυτών σε διάφορα κύτταρα. Η IL-1β χαρακτηρίζεται ως προφλεγμονώδη κυτταροκίνη και η δράση της συνδέεται συνήθως με καταστολή της βιοσύνθεσης και διέγερση της αποικοδόμησης των συστατικών του εξωκυτταρικού χώρου. Είναι γνωστό ότι η IL-1β επάγει την έκφραση των MMP-1 και MMP-3 σε διάφορα κύτταρα. Ωστόσο, υπό διερεύνηση παραμένει ο ακριβής μηχανισμός και τα ενδοκυτταρικά μονοπάτια που σηματοδοτούν. Είναι γνωστό ότι το μονοπάτι της cAMP/PKA ανταγωνίζεται την επαγωγική δράση της IL-1β στην παραγωγή της ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3 σε ινοβλάστες τραχήλου της μήτρας. Το πρωτεάσομα είναι ένα σύμπλοκο πρωτεάσης, εντοπισμένο στον πυρήνα και στο κυτοσόλιο, και αποικοδομεί επιλεκτικά τις ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες. Το πρωτεάσωμα έχει πολλαπλές δραστικότητες ενδοπεπτιδάσης που περιλαμβάνουν δράση όμοια με χυμοθρυψίνη, όμοια με κασπάση και παρόμοια με τρυψίνη, οι οποίες εντοπίζονται στις καταλυτικές υπομονάδες β5, β1 και β2, αντίστοιχα. Έχει βρεθεί ότι το πρωτεάσωμα παίζει κρίσιμο ρόλο σε μηχανισμούς ίνωσης και ότι η έκφραση των υπομονάδων του ρυθμίζεται προς τα άνω από τον IGF-1 και τον TGF-b1. Επιπρόσθετα, το πρωτεάσωμα μεσολαβεί επαγόμενη από TGF-b1 αυξημένη έκφραση του του ΤΙΜΡ-1 και του κολλαγόνου τύπου Ι. Δεδομένου ότι το πτερύγιο χαρακτηρίζεται από φλεγμονώδη διαδικασία, συμπεριλαμβανομένης της ίνωσης, αλλά και ότι ο TGF-b1 και ο IGF-1 εμπλέκονται σε διαδικασίες ίνωσης Σκοπός της παρούσης μεταπτυχιακής εργασίας σε πρώτο μέρος είναι η διαπίστωση της παρουσίας των παραγόντων TGF-b1 και IGF-1 στο πτερύγιο, αλλά και η διερεύνηση της εμπλοκής τους στην νόσο μέσω της επίδρασης τους στην έκφραση μορίων που έχουν παθογενετικό ρόλο στην νόσο. Σε δεύτερο μέρος, σκοπός είναι η μελέτη του σηματοδοτικού μονοπατιού της IL-1b που ακολουθείται κατά την παραγωγή της μεταλλοπρωτεινάσης MMP-1 σε ινοβλάστες πτερυγίου. Τέλος, είναι η διερεύνηση της ανταγωνιστικής επίδρασης του TGF-b στην διεγερτική δράση της IL-1b κατά την έκφραση της MMP-1 σε ινοβλάστες πτερυγίου, αλλά και του μηχανισμού μέσω του οποίου πραγματοποιείται η δράση αυτή. Τα κανονικά δείγματα επιπεφυκότα ελήφθησαν από τον υπερηχορηγιακό βολβικό επιπεφυκότα υγιών ατόμων που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση καταρράκτη. Τα δείγματα πτερυγίου ελήφθησαν από ασθενείς μετά τη χειρουργική αφαίρεση του πρωτογενούς ιστού. Οι ινοβλάστες απομονώθηκαν από τους ιστούς του πτερυγίου με ήπια κατεργασία με κολλαγενάση. Τα επίπεδα IL-6, ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3 σε ρυθμισμένα μέσα κυτταρικών καλλιεργειών προσδιορίστηκαν με ELISA. Επιπλέον, η ΜΜΡ-1 ταυτοποιήθηκε με ανάλυση Western blot. Η έκφραση IL-6, ΤΙΜΡ-1, τύπου Ι κολλαγόνου, πρωτεάσωμα υπομονάδων β5 και GAPDH στο επίπεδο mRNA επιβεβαιώθηκε με RT-PCR και αυτή της ΜΜΡ-1 με qPCR. Η δραστικότητα που προσομοιάζει με τη χυμοθρυψίνη της υπομονάδας πρωτεάσωσης β5 προσδιορίστηκε με φθορομετρική μέθοδο χρησιμοποιώντας το φθορογόνο υπόστρωμα Ν-σουκινυλ-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Succ-LLVY-AMC). Τα επίπεδα ενδοκυτταρικού αντιδραστικού είδους οξυγόνου (ROS) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη φθορίζουσα χρωστική, την διοξική 2, 7-διχλωροφθορεσκεΐνη (DCFH-DA). Η επιβίωση κυττάρων προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ. Υψηλή έκφραση της IL-6 παρατηρήθηκε στο πτερύγιο συγκριτικά με τον φυσιολογικό επιπεφυκότα. Όταν οι ινοβλάστες του πτερυγίου καλλιεργήθηκαν παρουσία του IGF-I του TGF-β1, παρατηρήθηκε δόσο-εξαρτώμενη επαγωγή της έκφρασης της IL-6. Η επαγόμενη από TGF-β1 ή IGF-I έκφραση της IL-6 καταστάλλειι σημαντικά παρουσία γενιστεϊνης αναστολέα κινασών τυροσίνης, ενώ ενισχύθηκε παρουσία του αναστολέα ΡΚΑ Η-89. Επιπλέον, η επαγόμενη από ΤΟΡ-β1 έκφραση της IL-6 καταστάλει παρουσία SB431542 και AG1478, αναστολέων της φωσφορυλίωσης SMAD και ενεργοποίησης EGFR, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι οι οδοί SMAD και EGFR εμπλέκονται στην επαγόμενη από TGF-β1 έκφραση της IL-6. Η επαγόμενη από TGF-β1 ή IGF-I έκφραση της IL-6 καταστάλλει επίσης παρουσία αναστολέων JNK, ρ38 και ΡΙ3-Κ, SP600125, SB203580 και LY294002 αντίστοιχα και δεν επηρεάστηκε παρουσία ΜΕΚ1 / 2 αναστολέα, U0126. Και οι δύο αυξητικοί παράγοντες ήταν σε θέση να αυξήσουν τα επίπεδα των ενδοκυτταρικών ROS. Ο συσσωρευτής ROS, WR 1065 καθώς και ο αναστολέας DPI του αναστολέα NADPH οξειδάσης (Noxs) κατέστειλε έντονα την επαγόμενη από TGF-β1 και IGF-I έκφραση της IL-6, υποδεικνύοντας ότι τα ROS, που παράγονται από Nox μπορεί να εμπλέκονται στην έκφραση της IL -6. Η επαγόμενη από TGF-β1 ή IGF-I παραγωγή της IL-6 καταστάλει επίσης παρουσία αναστολέων ενεργοποίησης δρασικότητας του πρωτεασώματος ή αναστολέα ενεργοποίησης του NF-κΒ, MG-132 ή Bay 11-7082 αντίστοιχα και κυρίως παρουσία του Bay 11-7082, υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ μπορεί να εμπλέκεται στην έκφραση της IL-6. Ο δύο αυξητικός παράγοντας επέδειξαν διαφορετική επίδραση στην έκφραση της β5 υπομονάδας του πρωτεασώματος. Ο TGF-β1προκάλεσε μια δόσο- εξαρτώμενη ενίσχυση της έκφρασης της υπομονάδας β5, ενώ ο IGF-I προκάλεσε μια δοσο-εξαρτώμενη καταστολή της έκφρασης της υπομονάδας β5. Το ίδιο αποτέλεσμα είχαν οι δύο παράγοντες επί της δραστικότητας της υπομονάδας πρωτεάσης β5. Και οι δύο αυξητικοί παράγοντες προκάλεσαν επίσης μία εξαρτώμενη από τη δόση ενίσχυση του κολλαγόνου τύπου Ι και της έκφρασης ΤΙΜΡ-1 σε ινοβλάστες πτερυγίου. Όταν οι ινοβλάστες του πτερυγίου καλλιεργήθηκαν με IL-1β, παρατηρήθηκε σημαντική διέγερση της έκφρασης ΜΜΡ-1, η οποία αναστέλλει σημαντικά από τους αναστολείς των ΜΑΡΚ; U0126, SP600125 και SB203580, κυρίως όμως από τον αναστολέα των JNK; SP600125, αλλά όχι από τον αναστολέα PY3-K LY294002. Η επαγόμενη από IL-1β έκφραση του ΜΜΡ-1 ενισχύθηκε παρουσία του αναστολέα ΡΚΑ; Η-89, ενώ καταστέλλεται έντονα παρουσία TGF-β1 ή φορσκολίνης, ενός ενεργοποιητή της αδενυλικής κυκλάσης. Ο αναστολέας ΡΚΑ; Η-89, σχεδόν εντελώς, ανέτρεψε την κατασταλτική επίδραση του TGF-β1 και της φορσκολίνης. Η κατασταλτική δράση του TGF-β1 αναστράφηκε επίσης παρουσία Na3V04, ενός μη ειδικού αναστολέα φωσφατασών, ενώ δεν επηρεάστηκε παρουσία της αναστολέας αδενυλικής κυκλάσης δι-δεοξυ-αδενοσίνης. Ο TGF-β1 καθώς επίσης και η φορσκολίνη δεν είχαν καμία επίδραση στην έκφραση ΜΚΡ-1, μίας ΜΑΡΚ φωσφατάσης. Ο TGF-β1 και η φορσκολίνη εμφάνισαν επίσης την ίδια επίδραση στην επαγόμενη από IL-1β έκφραση του ΜΜΡ-3. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι ο TGF-β1 και ο IGF-I μέσω διαφόρων οδών, συμπεριλαμβανομένων κινασών τυροσίνης, JNK, κινάσεων ρ-38, ενεργοποίησης ΡΙ3-Κ και ΝΡ-κΒ, προκαλούν την παραγωγή ROS, πιθανώς μέσω της δράσης μιας Nox. Εν συνεχεία εμπλέκονται στην επαγόμενη από TGF-β1 και IGF-I έκφραση της IL-6 σε ινοβλάστες πτεργίου. Έτσι, μπορεί να προταθεί ότι ο TGF-β1 και ο IGF-I, τουλάχιστον εν μέρει, είναι υπεύθυνοι για την υψηλή έκφραση της IL-6 στο πτερύγιο. Ο TGF-β1 και ο IGF-I επίσης, άμεσα ή μέσω της παραγόμενης από αυτά IL-6, ενισχύουν την έκφραση του κολλαγόνου τύπου Ι και του ΤΙΜΡ-1 που οδηγεί στην συσσώρευση εξωκυτταρικής μήτρας που παρατηρείται σε αυτόν τον ιστό. Ο TGF-β1 επίσης μέσω ενός μηχανισμού ανεξάρτητου από cAMP ενεργοποιεί την ΡΚΑ, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί μια φωσφατάση η οποία στη συνέχεια μεσολαβεί στην καταστολή της προκαλούμενης από IL-1β παραγωγής ΜΜΡ-1 από ινοβλάστες πτεργίου μέσω ενός άγνωστου μηχανισμού. Αυτή η επίδραση μπορεί επιπλέον να συνεισφέρει στην ανώμαλη συσσώρευση εξωκυττάριας μήτρας που παρατηρείται σε αυτή τη νόσο.