| Περίληψη: | Οι επισωματικοί φορείς αποτελούν την εναλλακτική επιλογή για την μεταφορά
γονιδίων σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας. Διπλασιάζονται αυτόνομα χωρίς να
ενσωματώνονται στα χρωμοσώματα του κυττάρου και έτσι στερούνται της σοβαρής
παρενέργειας του φαινομένου της μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Το
ενδιαφέρον ως προς την ανάπτυξη επισωματικών φορέων για την γονιδιακή μεταφορά
αυξήθηκε κατακόρυφα τα τελευταία χρόνια μετά την ανάπτυξη του φορέα pEPI-1, ο
οποίος περιείχε το στοιχείο S/MAR του γονιδίου της ανθρώπινης βήτα- ιντερφερόνης. Ο
φορέας αυτός είχε την ιδιότητα να διατηρείται επισωματικά χωρίς την ανάγκη
μεταγραφής κάποιου ιϊκού γονιδίου. Τα στοιχεία S/MAR αποτελούν ετερογενείς
περιοχές DNA οι οποίες συνδέονται στην θεμέλια ουσία του πυρήνα, συμμετέχοντας
στην οργάνωση του ευκαρυωτικού γονιδιώματος, στην αντιγραφή του DNA και στην
ρύθμιση της μεταγραφής. Αποφασίσαμε στην μελετήσουμε την δράση του S/MAR
στοιχείου σε ένα διαφορετικό περιβάλλον DNA. Ξεκινώντας από τον φορέα pCEP4 που
βασίζεται στα στοιχεία OriP και EBNA-1 του ιού η EBV κατασκευάσαμε τα εξής
πλασμίδια: 1) pEBS/eGFP με το S/MAR να είναι κλωνοποιημένο μετά το γονίδιο της
eGFP όπως στο pEPI-1. 2) pESdER / eGFP προερχόμενο από το pEBS/eGFP με
διαγραφή του γονιδίου EBNA-1 και.3) pCEP4 / eGFP (πλασμίδιο μάρτυρας). Σε
αντίθεση με τις προσδοκίες μας μόνο το πλασμιδίου pCEP4 / eGFP ήταν ικανό να
εγκαταστήσει σταθερές κυτταρικές σειρές Jurkat. Ο υπολογισμός της
αποσταθεροποίησης υπό τάση των παραπάνω πλασμιδίων απέδειξε μια υψηλή ουδό για
την αποσταθεροποίηση της περιοχής του OriP, σε αντίθεση με το μητρικό φορέα pCEP4,
γεγονός που οφείλεται στον ενεργειακό ανταγωνισμό μεταξύ του OriP και της υψηλά
αποσταθεροποιημένης περιοχής του S/MAR. Η αντικατάσταση του OriP στο πλασμίδιο
pESdER / eGFP από την περιοχή έναρξης της αντιγραφής το γονίδιο της β-σφαιρίνης
(IR) (pESdER-IR/eGFP) έχει ως αποτέλεσμα την αποκατάσταση της επισωματική της
κατάστασης, προσδίδοντας επιπλέον και υψηλή μιτωτική σταθερότητα χωρίς την ανάγκη
ύπαρξης πίεσης επιλογής σε καλλιέργειες για χρονικό διάστημα τριών μηνών. Συμπεράνουμε ότι το δυναμικό πολλαπλασιασμού ενός επισωματικού συστήματος που
περιέχει ένα στοιχείο S/MAR εξαρτάται από την ύπαρξη μιας δεύτερης υψηλά
αποσταθεροποιημένης έννοιες περιοχής ικανής να ξεπεράσει την σταθεροποιητική δράση
της αλληλουχίας S/MAR. Το γεγονός αυτό προσδίδει μια νέα διάσταση στη σχεδίαση
αυτόνομων επισωματικών φορέων, που περιέχει τον υπολογισμό της αποσταθεροποίησης
της διπλής έλικας DNA υπό τάση. Η ευρεία χρήση των ρετρο-ιϊκών φορέων ως συστήματα γονιδιακής μεταφοράς
σε κλινικές δοκιμές γονιδιακής θεραπείας έφερε στην επιφάνεια την ανάγκη για μια
ακριβή εκτίμηση της ασφάλειας των δοκιμών αυτών όσον αφορά το φαινόμενο της
μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Στην εργασία αυτή αναφέρεται μια νέα μέθοδος
για την ανίχνευση των θέσεων ενσωμάτωσης των ρετρο-ιϊκών φορέων που έχει κλινικό
προσανατολισμό και ονομάζεται DSCP-PCR( partially Double stranded, Sterically
Hindered Primer – PCR). Η μέθοδος αυτή έχει αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα,
δεδομένου ότι δεν εξαρτάται από στάδια κατάτμησης με ένζυμα περιορισμού και
αντιδράσεις λιγάσης που αποτελούν μέρος των υπαρχόντων μεθόδων (όπως η LAMPCR).
Η μείζονα διαφορά ανάμεσα στην DSCP-PCR και στις προηγούμενες PCR
μεθόδους συνιστάται στο στάδιο της σύνδεσης της συμπληρωματικής αλυσίδας του DNA
όπου χρησιμοποιείται ένας εκκινητής που το ένα άκρο του είναι εκφυλισμένο ενώ το
άλλο αποτελείται από διπλή έλικα DNA. Η σχεδίαση αυτή τον καθιστά ικανό να
προσδένεται μόνο στο άκρο οποιασδήποτε μονής αλυσίδας. Η μέθοδος αυτή παράγει ένα
υψηλά πληροφοριακό σύνολο δεδομένων για τον χαρακτηρισμό των θέσεων
ενσωμάτωσης των φορέων. Επίσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σύνθεση του προφίλ
των κλώνων που συμμετέχουν στην αιμοποίηση σε κάποια χρονική περίοδο. Η
παρακολούθηση το προφίλ αυτού μέσα στον χρόνο δίνει ενδείξεις για την κινητική της
αιμοποίησης και κατά συνέπεια της εμφάνιση νέων κλώνων.
|
|---|
