Απαλοιφή των υπομονάδων Rpp21 και Rpp29 της ανθρώπινης RNase P μέσω γονιδιωματικής επεξεργασίας και μελέτη του ρόλου τους
H ριβονουκλέαση P (RNase P) είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που συναντάται και στις τρεις επικράτειες της ζωής (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες). Είναι, μεταξύ άλλων, υπεύθυνη για την ωρίμανση της 5’ οδηγού -αλληλουχίας (5’ leader) των πρόδρομων μορίων tRNA (pre-tRNA). Μπορεί, όμως, να δράσ...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2020
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/14351 |
| id |
nemertes-10889-14351 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Ριβονουκλεάση P Γονιδιωματική επεξεργασία Μεταφορικό RNA Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης Ribonuclease P RNase P Genome editing CRISPR/Cas9 tRNA tRNA biogenesis Translation initiation |
| spellingShingle |
Ριβονουκλεάση P Γονιδιωματική επεξεργασία Μεταφορικό RNA Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης Ribonuclease P RNase P Genome editing CRISPR/Cas9 tRNA tRNA biogenesis Translation initiation Μπαλάση, Μαρία Απαλοιφή των υπομονάδων Rpp21 και Rpp29 της ανθρώπινης RNase P μέσω γονιδιωματικής επεξεργασίας και μελέτη του ρόλου τους |
| description |
H ριβονουκλέαση P (RNase P) είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που συναντάται και στις τρεις επικράτειες της ζωής (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες). Είναι, μεταξύ άλλων, υπεύθυνη για την ωρίμανση της 5’ οδηγού -αλληλουχίας (5’ leader) των πρόδρομων μορίων tRNA (pre-tRNA). Μπορεί, όμως, να δράσει και σε πρόσθετα υποστρώματα όπως, στο 5S rRNA καθώς και σε άλλα μη-κωδικά μόρια RNΑs (long non-coding RNAs, lncRNAs). Απαρτίζεται από μια RNA υπομονάδα (RPPH1) και από πρωτεϊνικές υπομονάδες (Rpp14, Rpp20, Rpp21, Rpp25, Rpp29, Rpp30, Rpp38, Rpp40, Pop5 και Pop1), ο αριθμός των οποίων ποικίλει από μια στα βακτήρια μέχρι δέκα στο πυρηνικό ολοένζυμο του ανθρώπου. Ορισμένες από τις πρωτεϊνικές της υπομονάδες, εκτός από τη συμμετοχή τους στη συναρμολόγηση του ολοενζύμου, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο και σε επιπρόσθετες κυτταρικές λειτουργίες, όπως είναι η μεταγραφή, η επιδιόρθωση βλαβών του γενετικού υλικού κ.α. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο βιολογικός ρόλος των πρωτεϊνικών υπομονάδων Rpp21 και Rpp29 στα καρκινικά κύτταρα τραχήλου μήτρας (HeLa), μέσω της χρήσης εργαλείου γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR/Cas9. Αρχικά, δημιουργηθήκαν οι τροποποιημένες κυτταρικές σειρές HeLa-ΔRpp21 και HeLa-ΔRpp29 για τις οποίες πιστοποιήθηκε η φύση της μετάλλαξης μέσω αλληλούχησης της θέσης στόχου. Οι συγκεκριμένες τροποποιήσεις δεν επηρέασαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων, ωστόσο ο ρυθμός πολλαπλασιασμού παρουσίασε σημαντική μείωση και για τις δυο τροποποιημένες κυτταρικές σειρές. Με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής (FACS) διαπιστώθηκε ότι μόνο στην περίπτωση της πρωτεϊνικής υπομονάδας Rpp21 παρουσιάστηκε συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G2/M του κυτταρικού κύκλου. Αντιθέτως, στην περίπτωση της Rpp29 η κατανομή των κυττάρων στις διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου δεν επηρεάστηκε. Για να διευκρινιστεί περαιτέρω ο ρόλος των υπομονάδων προσδιορίστηκε το προφίλ έκφρασης σημαντικών γονιδίων που εμπλέκονται στη μεταγραφή και στη μετάφραση μέσω RT-qPCR και παράλληλά μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην έναρξη της μετάφρασης μέσω ανασοαποτύπωσης κατά Western. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι η μετάφραση μειώνεται σημαντικά και στις δύο κυτταρικές σειρές. |
| author2 |
Balasi, Maria |
| author_facet |
Balasi, Maria Μπαλάση, Μαρία |
| author |
Μπαλάση, Μαρία |
| author_sort |
Μπαλάση, Μαρία |
| title |
Απαλοιφή των υπομονάδων Rpp21 και Rpp29 της ανθρώπινης RNase P μέσω γονιδιωματικής επεξεργασίας και μελέτη του ρόλου τους |
| title_short |
Απαλοιφή των υπομονάδων Rpp21 και Rpp29 της ανθρώπινης RNase P μέσω γονιδιωματικής επεξεργασίας και μελέτη του ρόλου τους |
| title_full |
Απαλοιφή των υπομονάδων Rpp21 και Rpp29 της ανθρώπινης RNase P μέσω γονιδιωματικής επεξεργασίας και μελέτη του ρόλου τους |
| title_fullStr |
Απαλοιφή των υπομονάδων Rpp21 και Rpp29 της ανθρώπινης RNase P μέσω γονιδιωματικής επεξεργασίας και μελέτη του ρόλου τους |
| title_full_unstemmed |
Απαλοιφή των υπομονάδων Rpp21 και Rpp29 της ανθρώπινης RNase P μέσω γονιδιωματικής επεξεργασίας και μελέτη του ρόλου τους |
| title_sort |
απαλοιφή των υπομονάδων rpp21 και rpp29 της ανθρώπινης rnase p μέσω γονιδιωματικής επεξεργασίας και μελέτη του ρόλου τους |
| publishDate |
2020 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/14351 |
| work_keys_str_mv |
AT mpalasēmaria apaloiphētōnypomonadōnrpp21kairpp29tēsanthrōpinēsrnasepmesōgonidiōmatikēsepexergasiaskaimeletētouroloutous AT mpalasēmaria depletionoftherpp21andrpp29subunitsfromhumanrnasepviagenomeeditingandstudiesontheirrole |
| _version_ |
1799945007321317376 |
| spelling |
nemertes-10889-143512022-09-06T05:12:45Z Απαλοιφή των υπομονάδων Rpp21 και Rpp29 της ανθρώπινης RNase P μέσω γονιδιωματικής επεξεργασίας και μελέτη του ρόλου τους Depletion of the Rpp21 and Rpp29 subunits from human RNase P via genome editing and studies on their role Μπαλάση, Μαρία Balasi, Maria Ριβονουκλεάση P Γονιδιωματική επεξεργασία Μεταφορικό RNA Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης Ribonuclease P RNase P Genome editing CRISPR/Cas9 tRNA tRNA biogenesis Translation initiation H ριβονουκλέαση P (RNase P) είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που συναντάται και στις τρεις επικράτειες της ζωής (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες). Είναι, μεταξύ άλλων, υπεύθυνη για την ωρίμανση της 5’ οδηγού -αλληλουχίας (5’ leader) των πρόδρομων μορίων tRNA (pre-tRNA). Μπορεί, όμως, να δράσει και σε πρόσθετα υποστρώματα όπως, στο 5S rRNA καθώς και σε άλλα μη-κωδικά μόρια RNΑs (long non-coding RNAs, lncRNAs). Απαρτίζεται από μια RNA υπομονάδα (RPPH1) και από πρωτεϊνικές υπομονάδες (Rpp14, Rpp20, Rpp21, Rpp25, Rpp29, Rpp30, Rpp38, Rpp40, Pop5 και Pop1), ο αριθμός των οποίων ποικίλει από μια στα βακτήρια μέχρι δέκα στο πυρηνικό ολοένζυμο του ανθρώπου. Ορισμένες από τις πρωτεϊνικές της υπομονάδες, εκτός από τη συμμετοχή τους στη συναρμολόγηση του ολοενζύμου, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο και σε επιπρόσθετες κυτταρικές λειτουργίες, όπως είναι η μεταγραφή, η επιδιόρθωση βλαβών του γενετικού υλικού κ.α. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο βιολογικός ρόλος των πρωτεϊνικών υπομονάδων Rpp21 και Rpp29 στα καρκινικά κύτταρα τραχήλου μήτρας (HeLa), μέσω της χρήσης εργαλείου γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR/Cas9. Αρχικά, δημιουργηθήκαν οι τροποποιημένες κυτταρικές σειρές HeLa-ΔRpp21 και HeLa-ΔRpp29 για τις οποίες πιστοποιήθηκε η φύση της μετάλλαξης μέσω αλληλούχησης της θέσης στόχου. Οι συγκεκριμένες τροποποιήσεις δεν επηρέασαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων, ωστόσο ο ρυθμός πολλαπλασιασμού παρουσίασε σημαντική μείωση και για τις δυο τροποποιημένες κυτταρικές σειρές. Με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής (FACS) διαπιστώθηκε ότι μόνο στην περίπτωση της πρωτεϊνικής υπομονάδας Rpp21 παρουσιάστηκε συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G2/M του κυτταρικού κύκλου. Αντιθέτως, στην περίπτωση της Rpp29 η κατανομή των κυττάρων στις διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου δεν επηρεάστηκε. Για να διευκρινιστεί περαιτέρω ο ρόλος των υπομονάδων προσδιορίστηκε το προφίλ έκφρασης σημαντικών γονιδίων που εμπλέκονται στη μεταγραφή και στη μετάφραση μέσω RT-qPCR και παράλληλά μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην έναρξη της μετάφρασης μέσω ανασοαποτύπωσης κατά Western. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι η μετάφραση μειώνεται σημαντικά και στις δύο κυτταρικές σειρές. Ribonuclease P (RNase P) is a ribonucleoprotein complex found in all domains of life (Bacteria, Archaea and Eukaryotes). It is responsible for the maturation of the 5' leader-sequence of pre-tRNA, however, it can also act on additional substrates, such as 5S rRNA as well as on other RNAs such as long non-coding RNAs (lncRNAs). Nuclear RNase P consists of a catalytic RNA subunit (RPPH1) and protein subunits (Rpp14, Rpp20, Rpp21, Rpp25, Rpp29, Rpp30, Rpp38, Rpp40, Pop5 and Pop1), whose number varies from one in bacteria to ten in mammals. Some of its protein subunits, apart from being part of the enzyme, play an important role in other cellular functions such as transcription, DNA damage repair, etc. To elucidate the biological role of the Rpp21 and Rpp29 protein subunits in cervical cancer cells (HeLa), we used the genome editing tool, CRISPR/Cas9. We created two genetically modified cell lines, HeLa-ΔRpp21 and HeLa-ΔRpp29, and we examined the type of the mutation. Also, we verified the elimination of Rpp21 in HeLa-ΔRpp21 modified cells subunit via Western blotting. Although the mutant cells are viable, their proliferation rate was significantly reduced in both cell lines. FACS analysis, though, showed that only the modified HeLa-ΔRpp21 cells were accumulated in the G2/M phase of the cell cycle. In the case of modified HeLa-ΔRpp29, the distribution of cells in the different phases of the cell cycle was not affected. To further investigate the role of these subunits, the expression profile of important genes involved in transcription and translation was determined via RT-qPCR. Moreover, the expression levels of proteins involved translation initiation process were assessed by Western Blot. The results indicate that translation rate is significantly reduced in both cell lines. 2020-12-14T07:50:34Z 2020-12-14T07:50:34Z 2020-12-08 http://hdl.handle.net/10889/14351 gr application/pdf |
