Ανάλυση του προτύπου μεθυλίωσης του γονιδίου Pnldc1 κατά την διαφοροποίηση

• Κύριος συγγραφέας: Κατσιούλας, Χρήστος
• Άλλοι συγγραφείς: Katsioulas, Christos
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2020
• Θέματα: Αποαδενυλίωση; Αποαδενυλάσες; Ριβονουκλεάσες; Αγγελειοφόρο RNA; Γενετική έκφραση; Μεταγραφικοί παράγοντες; Κυτταρική ανάπτυξη; Εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα; Μεθυλίωση; Πρότυπο μεθυλίωσης; Μεθυλοτρανσφεράση; Διαφοροποίηση; Deadenylation; PNLDC1; PARN-Like; Deadenylases; Gene expression; Ribonucleases; Transcription Factors; mRNA; Pyrosequencing; Methylation; Methylation pattern; DNMT3B; DNA Methyltransferase; Yamanaka; mESCs; Differentiation

Η κατάσταση της φυσιολογίας των κυττάρων κάθε χρονική στιγμή είναι άμεσο αποτέλεσμα της γονιδιακής έκφρασης, η ρύθμιση της οποίας απαιτεί έλεγχο των μορίων mRNA σε όλα τα στάδια του κυτταρικού κύκλου. Πολύ σημαντική δομή για την επίτευξη αυτού του ελέγχου είναι η poly(A) ουρά, που συμμετέχει σε διαδικασίες όπως ο έλεγχος της μεταγραφής, η ωρίμανση, η επεξεργασία, ο έλεγχος πιστότητας και η ανακύκλωση του mRNA. Η αποαδενυλίωση είναι η διαδικασία βράχυνσης της poly(A) ουράς και καταλύεται από ένζυμα με 3’-5’ δράση εξωνουκλεάσης. Αυτά τα ένζυμα καλούνται αποαδενυλάσες και χωρίζονται σε δύο οικογένειες, την DEDD (το όνομά της προκύπτει από τα συντηρημένα αμινοξέα του ενεργού κέντρου των ενζύμων που ανήκουν σε αυτήν) και την exonuclease- ndonucleasephosphatase (EEP) υπεροικογένεια. Μελέτες του εργαστηρίου μας δείχνουν πως το γονίδιο Pnldc1 κωδικοποιεί μια νέα αποαδενυλάση με υψηλή εξειδίκευση ως προς πολυαδενυλιωμένα υποστρώματα. Η PNLDC1 είναι η μόνη αποαδενυλάση που υπόκειται σε επιγενετική ρύθμιση και ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πως βρίσκεται κάτω από αυστηρό έλεγχο και πως σε διαφοροποιημένα κύτταρα εκφράζεται μόνο ύστερα από επίδραση με απομεθυλιωτικούς παράγοντες, όπως το 5’-AZA-CdR, το οποίο είναι φάρμακο που χρησιμοποιείται κυρίως για την θεραπεία μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων και της οξείας λευχαιμίας. Η PNLDC1 εκφράζεται ιστοειδικά, στα γαμετικά και τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, ενώ η έκφραση της μειώνεται κατά την ανάπτυξη υποδεικνύοντας πως έχει κάποιον σημαντικό ρόλο σε αυτήν την διαδικασία. Στην παρούσα διατριβή, παρατίθενται δεδομένα που αφορούν την δυναμική διακύμανση της έκφρασης των γονιδίων Pnldc1 και Dnmt3b κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης τα οποία οδηγούν στο συμπέρασμα πως η DNMT3B είναι υπεύθυνη για τη de novo μεθυλίωση του υποκινητή της Pnldc1. Με βάση τα ήδη υπάρχοντα αποτελέσματα που αφορούν το πρότυπο έκφρασης της Pnldc1, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ύστερα από καλλιέργεια διαφοροποιημένων και μη εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων για επτά ημέρες. Το γεγονός ότι τα κύτταρα αυτά διαφοροποιήθηκαν κάτω από συνθήκες απουσίας Lif επιβεβαιώθηκε τόσο από το φαινότυπο των κυττάρων όσο και μέσω RT-qPCR ανάλυσης για τον έλεγχο των επιπέδων έκφρασης σημαντικών γονιδίων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση όπως οι παράγοντες Yamanka, Bmp2, Lin28 και Nanog. Επιπρόσθετα, εξετάστηκε το πρότυπο μεθυλίωσης των νησίδων CpG στους υποκινητές των γονιδίων Pnldc1 και Dnmt3b κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων αυτών. Για να εξακριβωθεί το πρότυπο μεθυλίωσης, έγινε χρήση της μεθόδου του pyrosequencing έπειτα από μετατροπή διθειώδους νατρίου και ενίσχυση του προς ελέγχου γονιδιακού τόπου με PCR. Τα αποτελέσματα δείχνουν μία συνολική αύξηση των επιπέδων μεθυλίωσης τoυ Pnldc1 η οποία απαντάται σε κάθε διπλέτα CG που εξετάστηκε. Αντίθετα, δε παρατηρήθηκαν αλλαγές στα επίπεδα μεθυλίωσης της DNMT3B. Συνολικά, προτείνεται πως η PNLDC1 είναι η μοναδική αποαδενυλάση που ρυθμίζεται επιγενετικά και η χωροχρονική έκφρασή της επιτυγχάνεται μέσω μεθυλίωσης των νησίδων CpG από την DNA μεθυλοτρανσφεράση DNMT3B.