| Περίληψη: | Η διαδικασία της αντιγραφής του γενετικού υλικού αποτελείται από δυο διακριτά στάδια: το στάδιο της αδειοδότησης κατά την διάρκεια της G1 φάσης και το στάδιο της έναρξης κατά την μετάβαση από την G1 στην S φάση. Κατά την αδειοδότηση οι παράγοντες Cdt1 και Cdc18 στρατολογούν δυο ανενεργά σύμπλοκα των αντιγραφικών ελικασών, MCM, σε κάθε πιθανή αφετηρία της αντιγραφής. Στην συνέχεια, ένα μικρό υποσύνολο των αδειοδοτημένων αφετηριών ενεργοποιείται κατά την S προκειμένου να επιτευχθεί η έγκαιρη αντιγραφή ολόκληρου του γονιδιώματος. Παρά το γεγονός ότι η επιλογή των αφετηρίων χαρακτηρίζεται σε ένα βαθμό από στοχαστικότητα, αρκετοί είναι οι παράγοντες που επηρεάζουν την διαδικασία, και ανάμεσα σε αυτούς σημαντικό ρόλο διαδραματίζει η αρχιτεκτονική του πυρήνα και η τρισδιάστατη διαμόρφωση της χρωματίνης μέσα σε αυτόν.
Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση των παραπάνω παραγόντων στο πρόγραμμα της αντιγραφής, χρησιμοποιώντας τον οργανισμό μοντέλο S. pombe. Συνδυάζοντας δεδομένα που αφορούν την ακριβή θέση αλλά και την συχνότητα ενεργοποίησης (αποδοτικότητα) κάθε αφετηρίας, με το μοντέλο της τρισδιάστατης δομής του γονιδιώματος του S. pombe, παρατηρήσαμε μια χωρική διάκριση μεταξύ των αποδοτικών και μη αφετηριών, με τις πρώτες να οργανώνονται γύρω από την δομή των κεντρομερών, τα οποία βρίσκονται αγκυροβολημένα σε μια συγκεκριμένη θέση της πυρηνικής μεμβράνης. Πειράματα ανοσοφθορισμού που επιτρέπουν την παρατήρηση της πυροδότησης αφετηριών νωρίς στην S φάση, σε κύτταρα αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα κύτταρα που παρουσιάζουν μη φυσιολογική τοποθέτηση των κεντρομερών, υπέδειξαν ότι η μη σωστή διάταξη των τελευταίων επηρεάζει τον τρόπο διεξαγωγής της αντιγραφής στον χώρο. Στην συνέχεια, προκειμένου να επιβεβαιώσουμε πειραματικά την αρχική μας παρατήρηση, επισημάνθηκαν συγκεκριμένες αποδοτικές και μη αποδοτικές θέσεις έναρξης της αντιγραφής σε κάθε ένα από τα τρία χρωμοσώματα, χρησιμοποιώντας το σύστημα lacO-lacI, και η απόσταση τους από τα κεντομερή υπολογίστηκε στον τρισδιάστο χώρο του πυρήνα χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. Οι αποδοτικότητες έναρξης των αντίστοιχων αφετηριών υπολογίστηκαν με την χρήση ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο και συσχετίστηκαν με τις παραπάνω αποστάσεις. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν μια αντιστρόφως ανάλογη σχέση μεταξύ της απόστασης των αφετηριών από τα κεντρομερή και της αποδοτικότητάς τους. Προκειμένου να διαλευκάνουμε τη μοριακή βάση της σχέσης χωροδιάταξης-αποδοτικότητας των αφετηριών, διερευνήσαμε ένα πιθανό ρόλο του κύριου ρυθμιστή της αντιγραφής, Rif1, στην οργάνωση τους στον τρισδιάστατο χώρο του πυρήνα. Για το λόγο αυτό, οι αποστάσεις από τα κεντρομερή των ήδη σημασμένων αφετηριών υπολογίστηκαν σε κύτταρα αγρίου τύπου και Rif1Δ κύτταρα. Πράγματι, η πρωτεΐνη Rif1 επηρεάζει επιλεκτικά την θέση των αφετηριών που ρυθμίζει, υποδεικνύοντας έναν διαφορικό ρόλο του μορίου σαν οργανωτή της χρωματίνης.
Η χρονική διάκριση μεταξύ του σταδίου της αδειδότησης και της έναρξης της αντιγραφής διασφαλίζει την μια και μόνο μια φορά αντιγραφή του γενετικού υλικού σε κάθε κύκλο και επιτυγχάνεται μέσω του περιορισμού της ενεργότητας του Cdt1 και Cdc18 στην G1 φάση. Απορρύθμιση της έκφρασής τους οδηγεί σε επαναντιγραφή και σε αυξημένο αριθμό αντιγράφων συγκεκριμένων τμημάτων του γονιδιώματος. Ένα άλλο φαινόμενο που σχετίζεται με την εμφάνιση επιπλέον αντιγράφων, είναι η γονιδιακή ενίσχυση. Για την στοιχειοθέτηση μιας σχέση αιτίας-αποτελέσματος μεταξύ των δυο φαινομένων χρησιμοποιήθηκε κυτταρική σειρά με ικανότητα επαγόμενης υπέρκφρασης του cdc18. Προκλήθηκε επαγωγή επαναντιγραφής και η συχνότητα εμφάνισης αυξημένου αριθμού αντιγράφων παρατηρήθηκε μέσω γονιδίων, ικανών να προσδίδουν ανθεκτικότητα σε πολλαπλά αντίγραφα. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η επαναντιγραφή επάγει άμεσα την αυξημένου αριθμού αντιγράφων. Αλληλούχιση πλήρους γονιδιώματος σε ανθεκτικούς κλώνους υπέδειξε την εμφάνιση αυξημένων αντιγράφων με την μορφή μεγάλων, εξωχρωμοσωμικών ανεστραμμένων επαναλήψεων. Τέλος, προκειμένου να διαλευκάνουμε τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων που διαμεσολαβούν τον σχηματισμό των γονιδιωματικών αλλαγών μετά από επαναντιγραφή, η συχνότητα εμφάνισής των τελευταίων προσδιορίστηκε σε μεταλλάγματα που φέρουν απενεργοποιημένα συγκεκριμένα μονοπάτια επιδιόρθωσης κάθε φορά. Παρατηρήσαμε ότι, τα πολλαπλά αντίγραφα που προκύπτουν μέσω επαναντιγραφής, μετατρέπονται σε σταθερές γονιδιωματικές δομές μέσω διάφορων μονοπατιών του μηχανισμού επιδιόρθωσης του ομόλογου ανασυνδιασμού, τα οποία δρουν διαφορικά ανάλογα με τον γενετικό τόπο που ενισχύεται κάθε φορά.
Η αντιγραφή του γενετικού υλικού αποτελεί μια από τις σημαντικότερες διεργασίες στη ζωή του κυττάρου και ως εκ τούτου η διαλεύκανση των μηχανισμών ρύθμισης κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, αλλά και των επιπτώσεων της απορρύθμισής τους, θα μπορούσαν να συμβάλλουν σημαντικά στην βαθύτερη κατανόηση της βιολογίας σχετιζόμενων ασθενειών και την ανάπτυξη πιο αποδοτικών θεραπειών για αυτές.
|
|---|
