Μελέτη του πιθανού ρόλου του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 στην επιδιόρθωση των θραύσεων διπλής έλικας
Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας είναι ύψιστης σημασίας για την ομοιόσταση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, καθώς και για την προστασία έναντι στην καρκινογένεση. Ο κυτταρικός κύκλος αποτελεί μια πρόκληση για το κύτταρο, διότι προϋποθέτει τον διπλασιασμό του γενετικού υλικού κ...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2021
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/14745 |
| id |
nemertes-10889-14745 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Επιδιόρθωση θραύσεων διπλής έλικας Αδειοδότηση αντιγραφής Γονιδιωματική αστάθεια Genomic stability G1 phase |
| spellingShingle |
Επιδιόρθωση θραύσεων διπλής έλικας Αδειοδότηση αντιγραφής Γονιδιωματική αστάθεια Genomic stability G1 phase Προμπονάς, Στυλλιανός Συμεών Μελέτη του πιθανού ρόλου του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 στην επιδιόρθωση των θραύσεων διπλής έλικας |
| description |
Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας είναι ύψιστης σημασίας για
την ομοιόσταση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, καθώς και για την
προστασία έναντι στην καρκινογένεση. Ο κυτταρικός κύκλος αποτελεί μια
πρόκληση για το κύτταρο, διότι προϋποθέτει τον διπλασιασμό του γενετικού
υλικού και την μεταβίβασή του στα θυγατρικά κύτταρα σε ακέραια μορφή. Για τον σκοπό αυτό, υπάρχει έντονη επικοινωνία μεταξύ κυτταρικού κύκλου και
απόκρισης σε περίπτωση βλάβης του γενετικού υλικού. Ο παράγοντας Cdt1 είναι
μια πρωτεΐνη που επιτελεί αυτόν τον ρόλο. Η αντιγραφή ξεκινάει από
πολυάριθμες θέσεις πάνω στο γονιδίωμα που ονομάζονται θέσεις έναρξης και η
ρύθμιση της χωροχρονικής ενεργοποίησής τους είναι απαραίτητη για την ομαλή
εξέλιξη της αντιγραφής. Το Cdt1 εμπλέκεται σε μια διεργασία που ονομάζεται
«αδειοδότηση» των θέσεων έναρξης της αντιγραφής και συμβαίνει κατά την G1
φάση του κυτταρικού κύκλου. Κατά την φάση S, η πρωτεΐνη Geminin αλληλεπιδρά
με το Cdt1 και εμποδίζει την αδειοδότηση νέων θέσεων έναρξης εκτός της G1
φάσης. Η επιδιόρθωση των διασυνδέσεων μεταξύ δύο κλώνων του DNA
(Interstrand Cross Links, ICLs) είναι εξίσου σημαντική για την διατήρηση της
γονιδιωματικής σταθερότητας και την αντιμετώπιση του αντιγραφικού στρες. Την
επιδιόρθωση των ICLs αναλαμβάνει το μονοπάτι Fanconi Anemia (FA) κατά την S
φάση με κεντρικό ρόλο στην ενεργοποίηση του συγκεκριμένου μονοπατιού να έχει
η πρωτεΐνη FANCD2. Έχει δειχθεί πως ο παράγοντας Cdt1 συσσωρεύεται στα
σημεία βλάβης που έχουν προκληθεί με UV-A παλμικό laser. Στηριζόμενοι σε
αυτήν την παρατήρηση, θέλαμε να μελετήσουμε την πιθανή εμπλοκή του
παράγοντα Cdt1 στην επιδιόρθωση θραύσεων διπλής έλικας. Τα αποτελέσματα
μας δείχνουν μείωση στην μέση ένταση φθορισμού του δείκτη επιδιόρθωσης
γH2AX καθώς και μείωση του αριθμού των εστιών επιδιόρθωσης 53BP1 κατόπιν
αποσιώπησης του παράγοντα Cdt1 και παρουσία βλάβης. Αυτές οι παρατηρήσεις
προτείνουν ένα πιθανό ρόλο του Cdt1 στα πρωταρχικά βήματα της
σηματοδότησης στην επιδιόρθωση διπλών θραύσεων. Στο τελευταίο μέρος αυτής
της εργασίας προσπαθήσαμε να ενισχύσουμε την δραστικότητα χημικών
συνθετικών ενώσεων που διασπούν το σύμπλοκο Cdt1-Geminin και φαίνεται να
παρουσιάζουν αντικαρκινικές ιδιότητες. Επίσης, υπάρχουν ενδείξεις για αυξημένη
παρουσία κυτταρικής βλάβης κατόπιν ταυτόχρονης αποσιώπησης του FANCD2 και
της Geminin. Σε κάθε περίπτωση, προκαλείται κυτταρική βλάβη πιθανώς μέσω
υψηλού αντιγραφικού στρες. Για αυτό το λόγο χρησιμοποιήθηκε μια από αυτές τις
ενώσεις κατόπιν αποσιώπησης του παράγοντα FANCD2. Τα αποτελέσματα που
προέκυψαν δεν έδειξαν κάποια ουσιαστική αύξηση της βλάβης του DNA μεταξύ
χρήσης των ενώσεων και απαλοιφή του FANCD2. Δημιουργήθηκαν επίσης
πλασμίδια τα οποία θα μας επιτρέψουν να ελέγχουμε μεγάλο αριθμό ανάλογων
χημικών ενώσεων ως προς την ικανότητά τους να διασπούν το σύμπλοκο Geminin Cdt1 με την χρήση του συστήματος NanoBRET. |
| author2 |
Promponas, Styllianos Symeon |
| author_facet |
Promponas, Styllianos Symeon Προμπονάς, Στυλλιανός Συμεών |
| author |
Προμπονάς, Στυλλιανός Συμεών |
| author_sort |
Προμπονάς, Στυλλιανός Συμεών |
| title |
Μελέτη του πιθανού ρόλου του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 στην επιδιόρθωση των θραύσεων διπλής έλικας |
| title_short |
Μελέτη του πιθανού ρόλου του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 στην επιδιόρθωση των θραύσεων διπλής έλικας |
| title_full |
Μελέτη του πιθανού ρόλου του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 στην επιδιόρθωση των θραύσεων διπλής έλικας |
| title_fullStr |
Μελέτη του πιθανού ρόλου του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 στην επιδιόρθωση των θραύσεων διπλής έλικας |
| title_full_unstemmed |
Μελέτη του πιθανού ρόλου του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 στην επιδιόρθωση των θραύσεων διπλής έλικας |
| title_sort |
μελέτη του πιθανού ρόλου του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής cdt1 στην επιδιόρθωση των θραύσεων διπλής έλικας |
| publishDate |
2021 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/14745 |
| work_keys_str_mv |
AT promponasstyllianossymeōn meletētoupithanouroloutouadeiodotikouparagontatēsantigraphēscdt1stēnepidiorthōsētōnthrauseōndiplēselikas AT promponasstyllianossymeōn invastigatingthepotentialroleofthelicensingfactorcdt1indoublestrandbreakrepair |
| _version_ |
1771297153540423680 |
| spelling |
nemertes-10889-147452022-09-05T05:38:31Z Μελέτη του πιθανού ρόλου του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 στην επιδιόρθωση των θραύσεων διπλής έλικας Invastigating the potential role of the licensing factor Cdt1 in double strand break repair Προμπονάς, Στυλλιανός Συμεών Promponas, Styllianos Symeon Επιδιόρθωση θραύσεων διπλής έλικας Αδειοδότηση αντιγραφής Γονιδιωματική αστάθεια Genomic stability G1 phase Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας είναι ύψιστης σημασίας για την ομοιόσταση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, καθώς και για την προστασία έναντι στην καρκινογένεση. Ο κυτταρικός κύκλος αποτελεί μια πρόκληση για το κύτταρο, διότι προϋποθέτει τον διπλασιασμό του γενετικού υλικού και την μεταβίβασή του στα θυγατρικά κύτταρα σε ακέραια μορφή. Για τον σκοπό αυτό, υπάρχει έντονη επικοινωνία μεταξύ κυτταρικού κύκλου και απόκρισης σε περίπτωση βλάβης του γενετικού υλικού. Ο παράγοντας Cdt1 είναι μια πρωτεΐνη που επιτελεί αυτόν τον ρόλο. Η αντιγραφή ξεκινάει από πολυάριθμες θέσεις πάνω στο γονιδίωμα που ονομάζονται θέσεις έναρξης και η ρύθμιση της χωροχρονικής ενεργοποίησής τους είναι απαραίτητη για την ομαλή εξέλιξη της αντιγραφής. Το Cdt1 εμπλέκεται σε μια διεργασία που ονομάζεται «αδειοδότηση» των θέσεων έναρξης της αντιγραφής και συμβαίνει κατά την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Κατά την φάση S, η πρωτεΐνη Geminin αλληλεπιδρά με το Cdt1 και εμποδίζει την αδειοδότηση νέων θέσεων έναρξης εκτός της G1 φάσης. Η επιδιόρθωση των διασυνδέσεων μεταξύ δύο κλώνων του DNA (Interstrand Cross Links, ICLs) είναι εξίσου σημαντική για την διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας και την αντιμετώπιση του αντιγραφικού στρες. Την επιδιόρθωση των ICLs αναλαμβάνει το μονοπάτι Fanconi Anemia (FA) κατά την S φάση με κεντρικό ρόλο στην ενεργοποίηση του συγκεκριμένου μονοπατιού να έχει η πρωτεΐνη FANCD2. Έχει δειχθεί πως ο παράγοντας Cdt1 συσσωρεύεται στα σημεία βλάβης που έχουν προκληθεί με UV-A παλμικό laser. Στηριζόμενοι σε αυτήν την παρατήρηση, θέλαμε να μελετήσουμε την πιθανή εμπλοκή του παράγοντα Cdt1 στην επιδιόρθωση θραύσεων διπλής έλικας. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν μείωση στην μέση ένταση φθορισμού του δείκτη επιδιόρθωσης γH2AX καθώς και μείωση του αριθμού των εστιών επιδιόρθωσης 53BP1 κατόπιν αποσιώπησης του παράγοντα Cdt1 και παρουσία βλάβης. Αυτές οι παρατηρήσεις προτείνουν ένα πιθανό ρόλο του Cdt1 στα πρωταρχικά βήματα της σηματοδότησης στην επιδιόρθωση διπλών θραύσεων. Στο τελευταίο μέρος αυτής της εργασίας προσπαθήσαμε να ενισχύσουμε την δραστικότητα χημικών συνθετικών ενώσεων που διασπούν το σύμπλοκο Cdt1-Geminin και φαίνεται να παρουσιάζουν αντικαρκινικές ιδιότητες. Επίσης, υπάρχουν ενδείξεις για αυξημένη παρουσία κυτταρικής βλάβης κατόπιν ταυτόχρονης αποσιώπησης του FANCD2 και της Geminin. Σε κάθε περίπτωση, προκαλείται κυτταρική βλάβη πιθανώς μέσω υψηλού αντιγραφικού στρες. Για αυτό το λόγο χρησιμοποιήθηκε μια από αυτές τις ενώσεις κατόπιν αποσιώπησης του παράγοντα FANCD2. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν δεν έδειξαν κάποια ουσιαστική αύξηση της βλάβης του DNA μεταξύ χρήσης των ενώσεων και απαλοιφή του FANCD2. Δημιουργήθηκαν επίσης πλασμίδια τα οποία θα μας επιτρέψουν να ελέγχουμε μεγάλο αριθμό ανάλογων χημικών ενώσεων ως προς την ικανότητά τους να διασπούν το σύμπλοκο Geminin Cdt1 με την χρήση του συστήματος NanoBRET. Maintenance of genomic stability is of crucial importance for cell homeostasis and proliferation as well as protection from cancer development and progression. Cell cycle completion creates a challenge for the cell, as it requires faithful duplication of the genome and chromosome segregation, while avoiding any DNA sequence alterations. For that reason, there is a constant crosstalk between the cell cycle and the DNA Damage Response. Cdt1 a protein with this exact function. DNA replication starts from numerous sites on the genome called origins of replication and their activation in space and time is important for normal replication completion. Cdt1 is involved in a process called origin «licensing», which happens mainly in the G1 phase of the cell cycle. During S phase, Cdt1 interactions with Geminin inhibit any further licensing. DNA double strand breaks (DSBs) are one of the most dangerous types of DNA lesion and their inappropriate repair leads to genome instability. Eukaryotic cells employ two main pathways to repair DSBs, namely Homologous Recombination (HR and Non-Homologous End Joining (NHEJ). The repair of Interstrand Cross-links (ICLs) is also important for genomic stability. ICLs can be caused from the endogenous metabolism or by external factors. ICL repair is mediated by the Fanconi Anemia (FA) pathway, which operates mainly during S phase. The Fanconi Anemia pathway detects and removes ΙCLs and FANCD2 has a central role in the FA pathway activation. Cdt1 has been shown to accumulate at sites of DNA damage induced by UV-A pulsed laser. Based on this observation, we wanted to investigate the potential involvement of Cdt1 in DSB repair. Our results suggest a potential involvement of Cdt1 in the early step of double strand break repair signalling. In the last part of this thesis, we aimed to enhance the potency of chemical compounds that disrupt the Geminin-Cdt1 complex and exhibit anti-cancer potential. For that reason, we used one of these compounds in the absence of FANCD2. Our results showed no detectable synthetic – lethal interactions between FANCD2 depletion and compound treatment. Finally, we generated plasmids that will allow us to screen a high number of chemical analogues for their ability to disrupt Cdt1-Geminin interactions using the NanoBretTM technology. 2021-04-07T15:57:38Z 2021-04-07T15:57:38Z 2020-12-21 http://hdl.handle.net/10889/14745 gr application/pdf |
