Μελέτη της επίδρασης πεπτιδίων στη σύνθεση και στις ιδιότητες των νανοσωματιδίων αργύρου για τοπική εφαρμογή

• Main Author: Παπαϊωάννου, Αφροδίτη
• Other Authors: Papaioannou, Afroditi
• Language: Greek
• Published: 2021
• Subjects: Νανοσωματίδια αργύρου; Πεπτίδια; Επούλωση; Silver nanoparticles; AgNPs; Peptides; Wound healing

Είναι ευρέως αποδεκτό πως τα νανοσωματίδια αργύρου (ΑgNPs) αποκτούν συνεχώς όλο και μεγαλύτερο έδαφος στον κόσμο της επιστημονικής κοινότητας, ενώ παράλληλα διεκδικούν συνεχώς αυξανόμενο μερίδιο στις δραστηριότητες της βιομηχανίας των φαρμάκων και της κοσμητολογίας. Το γεγονός αυτό οφείλεται κυρίως στα μοναδικά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τους, τα οποία τους προσδίδουν πολλαπλές πολύτιμες ιδιότητες . Έτσι, ως αντικείμενο της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας επιλέχθηκε η σύνθεση AgNPs υπό την επίδραση πεπτιδίων, ενός άλλου πολλά υποσχόμενα κεφαλαίου στον κόσμο της έρευνας, και η μελέτη του τρόπου με τον οποίο τα δεύτερα επιδρούν στις ιδιότητες των μεταλλικών αυτών νανοσωματιδίων. Τα πεπτίδια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα Myristoyl Tetrapeptide-6 (Πεπτίδιο 1), και το σύμπλοκο Copper Tripeptide-1 (Πεπτίδιο 2). Τα εμπορικά διαθέσιμα αυτά συστατικά είναι γνωστά για τις κοσμητολογικές τους ιδιότητες και την πιθανή επουλωτική τους δράση. Με το κάθε ένα πεπτίδιο παρασκευάστηκαν συζεύγματα ΑgNPs-πεπτιδίου με δύο τρόπους: α) με την προσθήκη του πεπτιδίου κατά την αντίδραση σύνθεσης των νανοσωματιδίων και β) με την προσθήκη του πεπτιδίου σε έτοιμη διασπορά ΑgNPs. Τα τέσσερα αυτά παρασκευάσματα αποτέλεσαν τα υπό μελέτη δείγματα και συγκρίθηκαν τόσο μεταξύ τους, όσο και με τα άνευ επίδρασης πεπτιδίου ΑgNPs. Υψίστης σημασίας τμήμα του πειράματος ήταν η διερεύνηση της επίπτωσης του κάθε πεπτιδίου στα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των αντίστοιχων νανοσωματιδίων, η οποία επιτεύχθηκε με τη χρήση των αναλυτικών τεχνικών: UV/Vis, DLS, TEM, XRD, ΑΑS, και FT-IR. Αρχικά, η επιτυχία της σύνθεσης των AgNPs επιβεβαιώθηκε με την χρήση της φασματοσκοπίας UV/Vis, ενώ το μέγεθος, η ομοιομορφία και το ζ- δυναμικό τους μελετήθηκε με DLS. Με τη βοήθεια του DLS πραγματοποιήθηκε, επιπλέον, και η μελέτη σταθερότητας των διασπορών AgNPs σε χρονική περίοδο βάθους τριών μηνών. Για την επίτευξη της μικροσκοπικής ανάλυσης ως προς τη μορφολογία και τα μεγέθη των ΑgΝΡs που παρασκευάστηκαν έγινε χρήση ΤΕΜ, ενώ η κρυσταλλικότητά τους μελετήθηκε με τη μέθοδο XRD και με τη βοήθεια των SAED patterns από το ΤΕΜ. Επιπροσθέτως, η φασματοσκοπία FT-ΙR, αποκάλυψε την προσρόφηση οργανικών ομάδων των πεπτιδίων στην επιφάνεια των AgNPs και, έτσι, επιβεβαίωσε την ενσωμάτωσή τους σε αυτά. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ανάλυση με ΑΑS σε κλίβανο γραφίτη, μια τεχνική ατομικής φασματοσκοπίας, με σκοπό την ταυτοποίηση της ύπαρξης αργύρου αλλά και την ποσοτικοποίησή του στα AgNPs. Με τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του Αg υπολογίστηκε και η απόδοση της διαδικασίας σύνθεσης των ΑgNPs των δειγμάτων. Στα νανοσωματίδια που αλληλεπέδρασαν με το πεπτίδιο 1 υπολογίστηκε απόδοση 82,68 %, όταν αυτό προστέθηκε κατά την αντίδραση της σύνθεσης των AgNPs, και 56,67 %, όταν προστέθηκε σε ύστερο χρόνο. Από την άλλη, στα νανοσωματίδια που αλληλεπέδρασαν με το Πεπτίδιο 2 υπολογίστηκε απόδοση 64,78 %, όταν αυτό προστέθηκε κατά την αντίδραση της σύνθεσης των AgNPs και 13,14 %, όταν προστέθηκε σε ύστερο χρόνο. Η απόδοση των συμβατικών ΑgNPs, τα οποία συντέθηκαν με χημική αναγωγή άνευ επίδρασης πεπτιδίου, υπολογίστηκε 88,68 %. Βάσει της απόδοσης και της σταθερότητας αποσαφηνίστηκε, επίσης, και η βέλτιστη μέθοδος σύνθεσης συζευγμάτων ΑgNPs - πεπτιδίου. Συγκεκριμένα, αποδείχθηκε πως η διαδικασία προσθήκης των πεπτιδίων κατά τη διάρκεια σύνθεσης των AgNPs υπερτερεί έναντι της πρόσθεσής τους, ύστερα, σε έτοιμα νανοσωματίδια. Η διαφορά στις αποδόσεις μεταξύ των δύο μεθόδων ήταν κατά μέσο όρο 38,83 % για τα δύο πεπτίδια και αποτέλεσε την βασική παράμετρο επιλογής της βέλτιστης εκ των δύο, μιας και όλες οι διασπορές ΑgNPs επέδειξαν αρκετά καλή τρίμηνη σταθερότητα. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μελέτη της επουλωτικής δράσης των δύο αυτών βέλτιστων διασπορών AgNPs με τη μέθοδο SWAs. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν φυσιολογικοί ινοβλάστες ποντικού (NΙΗ3Τ3) και η παρακολούθηση της πορείας της επούλωσης διήρκησε 48h. Κατά τη διερεύνηση της επουλωτικής δράσης διαπιστώθηκε ικανότητα επούλωσης 71,97% ± 4,35%, στο πρώτο 24ωρο και 70,91% ± 2,62% στο δεύτερο 24ωρο για τη διασπορά των AgNPs, τα οποία αλληλεπέδρασαν με το DermaPep® A420,ενώ για τη διασπορά των AgNPs, τα οποία αλληλεπέδρασαν με το DermaPepTM CuP_S υπολογίστηκε επουλωτική δράση 62,37% ± 18,33% και 72,39% ± 12,17% για τα δύο 24ωρα, αντιστοίχως. Από τα αποτελέσματα της δοκιμασίας SWAs, εξήχθη το συμπέρασμα πως και τα δύο πεπτίδια, όταν ενσωματώνονται σε ΑgNPs, παρουσιάζουν αυξημένη επουλωτική δράση σε σχέση με αυτήν στην ελεύθερη μορφή τους, γεγονός το οποίο ισχύει και για τα δύο 24ωρα που διήρκησε η μελέτη. Για την πρώτη διασπορά στις 24 και στις 48 ώρες, αντίστοιχα, η επουλωτική δράση είναι 5,48 και 3,33 φορές μεγαλύτερη από αυτή του ελεύθερου Πεπτιδίου 1. Για τη δεύτερη διασπορά αποδείχθηκε υπεροχή αυτής ως προς την ικανότητα επούλωσης, έναντι του ελεύθερου Πεπτιδίου 2, 2,82 φορές για το πρώτο και 2,34 φορές για το δεύτερο 24ωρο, αντίστοιχα. Επιπλέον, η επουλωτική δράση των διασπορών αυτών σε σχέση με τα ΑgNPs που δεν αλληλεπέδρασαν με κάποιο πεπτίδιο είναι, επίσης, καλύτερη. Έτσι, διαπιστώθηκε συνέργεια ως προς την δράση επούλωσης μεταξύ AgNPs και των δύο πεπτιδίων που μελετήθηκαν.