Ανάπτυξη καινοτόμου βιοδιυλιστηρίου για την παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης και προϊόντων διατροφής προστιθέμενης αξίας από υποπροϊόν τυποποίησης κορινθιακής σταφίδας

• Κύριος συγγραφέας: Πλειώνη, Ίρις
• Άλλοι συγγραφείς: Plioni, Iris
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2021
• Θέματα: Κορινθιακή σταφίδα; Υποπροϊόν τυποποίησης; Βιοτεχνολογική αξιοποίηση; Οίνος; Ξύδι; Γλυκαντικές ύλες; Βακτηριακή κυτταρίνη; Μαγιά αρτοποιίας; Τεχνοοικονομική ανάλυση; Προστιθέμενη αξία; Corinthian currants; Finishing side-stream; Biotechnological exploitation; Wine; Vinegar; Sweeteners; Bacterial cellulose; Baker’s yeast; Technoeconomic analysis; Added value

Η Κορινθιακή σταφίδα προέρχεται από τη φυσική αποξήρανση των σταφυλιών της ποικιλίας σταφυλιού Vitis vinifera L. var. Apyrena και αποτελεί αρχαίο εθνικό προϊόν. Δεν υφίσταται θερμική επεξεργασία, προσθήκη γλυκαντικών μέσων ή άλλων προσθέτων, και μπορεί να καταναλωθεί αυτούσια ή να προστεθεί σε προϊόντα αρτοποιίας, ζαχαροπλαστικής και μαγειρικής, ενώ με κατάλληλη κατεργασία μπορεί να μετατραπεί σε σιρόπι ή συμπυκνωμένο γλεύκος και να χρησιμοποιηθεί ως γλυκαντική ύλη (σταφιδίνη) ή ως πρώτη ύλη για την παραγωγή οινοπνεύματος και ποτών. Σήμερα, η Κορινθιακή σταφίδα εξακολουθεί να αποτελεί ένα από τα βασικότερα εξαγωγικά προϊόντα της Ελλάδας, με την Κορινθιακή σταφίδα Βοστίτσα να είναι η ανώτερη ποιοτικά. Ωστόσο, οι παραγόμενες ποσότητες ξηρής σταφίδας είναι δυστυχώς σταθερά φθίνουσες κυρίως λόγω του μεγάλου κόστους παραγωγής, και της έλλειψης κυβερνητικών επιδοτήσεων. Μια εταιρεία τυποποίησης Κορινθιακής σταφίδας παράγει μεγάλες ποσότητες υποπροϊόντος τυποποίησης (ΥΤΚ) ή «βιομηχανικού παρακρατήματος» (5-6% της πρώτης ύλης), το οποίο διαφέρει από το εμπορεύσιμο προϊόν κυρίως στο μέγεθος των καρπών (<4 mm, >8 mm), και την παρουσία γιγάρτων. Η χημική σύσταση και το αρωματικό προφίλ (πτητικές ενώσεις) του ΥΤΚ δεν έχουν μελετηθεί, και αποτελούν έναν από τους στόχους της διατριβής. Επίσης, το ΥΤΚ χρησιμοποιείται σήμερα σχεδόν αποκλειστικά για την παραγωγή ξυδιού με ζύμωση βυθού, όπως μέχρι πρόσφατα όριζε η Ελληνική νομοθεσία. Ωστόσο, το ΥΤΚ παρουσιάζει μεγάλες δυνατότητες βιοτεχνολογικής εκμετάλλευσης ως πρώτη ύλη πλούσια σε ζυμώσιμα σάκχαρα (γλυκόζη, φρουκτόζη και σακχαρόζη, ~70%). Έτσι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας, που αποτελεί σήμερα πραγματικό ζητούμενο για τις εταιρείες τυποποίησης σταφίδας, ειδικά μετά την άρση της αντίστοιχης περιοριστικής νομοθεσίας για την χρήση του ΥΤΚ. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η αναβάθμιση του ΥΤΚ, υπό την ιδέα του «Βιοδιυλιστηρίου», μέσω αξιοποίησής του για την παραγωγή διάφορων προϊόντων διατροφής, προστιθέμενης αξίας (γλυκαντικές ύλες, ξύδι, οίνοι, μικροβιακές καλλιέργειες για τρόφιμα), αλλά και προϊόντων βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος (βακτηριακή κυτταρίνη). Επίσης, στόχος είναι η ανάπτυξη νέων μεθόδων παραγωγής των παραπάνω, οδηγώντας σε προϊόντα με καλή οργανοληπτική και διατροφική ποιότητα και διατηρησιμότητα, καθώς και με χαμηλό κόστος παραγωγής, που αποτελούν βασικές προϋποθέσεις για την βιομηχανική εφαρμογή τους. Το δε «βιοδιυλιστήριο», είναι μια από τις βασικές στρατηγικές για την επίτευξη «Κυκλικής Οικονομίας», μέσω του οποίου μπορεί να κλείσουν οι «Βρόγχοι» των πρώτων υλών, μετατρέποντας υπολείμματα διεργασιών σε χρήσιμα προϊόντα, με πολλαπλά κοινωνικά, οικονομικά και περιβαλλοντικά οφέλη. Στόχος της διατριβής ήταν επίσης η χημική ανάλυση του ΥΤΚ και των προϊόντων από ΥΤΚ, με έμφαση στο φαινολικό περιεχόμενο, την αντιοξειδωτική ικανότητα και το αρωματικό προφίλ, όσον αφορά τα προϊόντα διατροφής, και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά υφής όσον αφορά τη βακτηριακή κυτταρίνη (που βρίσκει εφαρμογές τόσο στην παραγωγή τροφίμων όσο και υλικών). Στο Πρώτο Μέρος της διατριβής γίνεται μια διεξοδική επισκόπηση της βιβλιογραφίας όσον αφορά την υφιστάμενη κατάσταση σχετικά με την αξιοποίηση αποβλήτων και υποπροϊόντων της βιομηχανίας τροφίμων, στο πλαίσιο επίτευξης κυκλικής οικονομίας. Επίσης, αναφέρονται στοιχεία για την Κορινθιακή σταφίδα (παραγωγή, σύσταση, νομοθεσία, βιομηχανικό παρακράτημα, και υφιστάμενη κατάσταση στον αγροτοβιομηχανικό κλάδο παραγωγής και επεξεργασίας της). Στη συνέχεια, γίνεται αναφορά στα προϊόντα που μπορούν να προκύψουν από σταφίδα ή σταφύλι, και που αποτελούν στόχους της διατριβής (σταφιδίνη, σταφιδίτης οίνος, ξύδι, βακτηριακή κυτταρίνη, μικροβιακές καλλιέργειες για τρόφιμα). Αναφέρονται επίσης στοιχεία για την υφιστάμενη οικονομική κατάσταση αυτών των κλάδων σε παγκόσμιο επίπεδο, για τις μεθόδους παραγωγής των προϊόντων, τη χημική σύσταση και διατροφική τους αξία, καθώς και τις νέες τάσεις στην παραγωγή τους σε επιστημονικό και βιομηχανικό επίπεδο. Στο Δεύτερο Μέρος της διατριβής περιγράφεται αναλυτικά ο πειραματικός σχεδιασμός της διατριβής. Αναφέρονται οι πρώτες ύλες, οι μικροοργανισμοί, τα χημικά αντιδραστήρια, και ο εργαστηριακός εξοπλισμός που χρησιμοποιήθηκε, και περιγράφονται λεπτομερώς όλες οι αναλυτικές τεχνικές και οι πειραματικές πορείες που εφαρμόστηκαν ή αναπτύχθηκαν στη διατριβή. Στο Τρίτο Μέρος παρουσιάζονται τα αποτελέσματα και συμπεράσματα της διατριβής. Αρχικά πραγματοποιήθηκε ανάλυση της σύστασης και του αρωματικού προφίλ του ΥΤΚ και έγινε σύγκρισή του με το εμπορεύσιμο προϊόν από το οποίο προήλθε το ΥΤΚ (Κορινθιακή σταφίδα Βοστίτσα). Η κύρια διαφορά μεταξύ των δύο, όπως προαναφέρθηκε, είναι το μέγεθος των καρπών, η ποσότητα των φλοιών που περιέχουν και η παρουσία γιγάρτων και μίσχων. Οι διαφορές αυτές βρέθηκε ότι αντανακλούν και στη χημική σύσταση του ΥΤΚ. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ολική συγκέντρωση σακχάρου (~71% w/w), η πρωτεΐνη (2,6% w/w), η τέφρα, το pH, η ολική οξύτητα και τα οργανικά οξέα ήταν σε παρόμοια επίπεδα στο ΥΤΚ και στο εμπορικό προϊόν, ενώ η περιεχόμενη υγρασία, το λίπος (0,66% w/w), η πτητική οξύτητα (0,2% ως οξικό οξύ), το φαινολικό περιεχόμενο και η αντιοξειδωτική ικανότητα ήταν αυξημένα στο ΥΤΚ. Ο διαφορές αυτές, εκτός από τη διαφορετική φύση του ΥΤΚ, μπορεί να αποδοθούν και στην διαφορετική μεταχείριση του ΥΤΚ στο εργοστάσιο σε σχέση με την εμπορεύσιμη σταφίδα μετά το διαχωρισμό τους. Ειδικότερα, η αυξημένη αντιοξειδωτική ικανότητα (μ.ο. 2,40 AAE/g) και το φαινολικό περιεχόμενο (μ.ο. 4,8 mg GAE/g) του ΥΤΚ σε σύγκριση με την εμπορεύσιμη σταφίδα (μ.ο. 1,9 mg GAE/g και 2,40 AAE/g, αντίστοιχα), οφείλεται στην παρουσία γιγάρτων που είναι πλούσια σε αντιοξειδωτικές φαινόλες, και πιθανώς στην χημική τροποποίηση των φαινολών της σταφίδας κατά την επεξεργασία και διαλογή. Το ΥΤΚ παρουσιάζει επίσης πλούσιο προφίλ πτητικών ενώσεων που επηρεάζουν το άρωμα. Συγκεκριμένα, ταυτοποιήθηκαν με SPME GC-MS 160 ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων (1) πτητικών ενώσεων από την πρώτη ύλη (σταφύλι και μέρη του φυτού της αμπέλου), (2) προϊόντων θερμικής διάσπασης των σακχάρων, που προκύπτουν κατά την αφυδάτωση των σταφίδων, όπως ενώσεις των αντιδράσεων Maillard και Strecker (π.χ., διακετύλιο, φουρφουράλη, φαινυλακεταλδεΰδη, Strecker αλδεΰδες), και (3) ενώσεων του μεταβολισμού των λιπιδίων (π.χ., εξανάλη, επτανάλη, 2-επτενάλη, 2,4-δεκαδιενάλη, 2-εννεανάλη), που πιθανώς προέκυψαν τόσο από το μεταβολισμό της αμπέλου όσο και κατά την επεξεργασία της σταφίδας (ξήρανση, αποθήκευση, τυποποίηση). Η πλειοψηφία των ενώσεων αυτών ταυτοποιήθηκαν και στα προϊόντα από ΥΤΚ. Τέλος, ανιχνεύθηκαν, τόσο στο ΥΤΚ όσο και στα προϊόντα του, ενώσεις που δεν προέρχονται από το σταφύλι, αλλά η παρουσία τους μπορεί να αποδοθεί σε προσμίξεις, όπως από άλλα μέρη του φυτού της αμπέλου (π.χ., L-βορνεόλη από τους βοστρύχους), και από ζιζάνια της αμπέλου (π.χ., θουγιόνη). Εκτός φυσικά των παραπάνω, οι διαφορές μεταξύ του ΥΤΚ και του εμπορικού προϊόντος επηρεάζονται επίσης από τις εδαφοκλιματικές συνθήκες, τις εφαρμοζόμενες αγροτικές πρακτικές, το έτος συγκομιδής, αλλά και τον τρόπος ξήρανσης της σταφίδας. Τα επίπεδα οξύτητας και η παρουσία συγκεκριμένων πτητικών ενώσεων (όπως οξικοί εστέρες, ανώτερες αλκοόλες, αλειφατικοί υδρογονάνθρακες, κ.α.) στο ΥΤΚ, αποτελούν ένδειξη μικροβιακής αλλοίωσης. Για το λόγο αυτό προτείνεται να τροποποιηθεί η διαχείριση του ΥΤΚ στο εργοστάσιο, μετά από το διαχωρισμό του από το εμπορεύσιμο προϊόν, ώστε να μειωθεί το μικροβιακό του φορτίο και να περιοριστούν οι αλλοιώσεις, ειδικά όταν πρόκειται να αξιοποιηθεί για την παραγωγή προϊόντων διατροφής. Η παρουσία μυκοτοξινών στο ΥΤΚ θα πρέπει επίσης να διερευνηθεί. Όσον αφορά το στερεό υπόλειμμα (ΣΥΤΚ) που απομένει μετά την υδατική εκχύλιση του ΥΤΚ για την παραγωγή των διάφορων προϊόντων της διατριβής, αυτό βρέθηκε ότι περιέχει μικρότερο ποσοστό ολικού αζώτου (πρωτεΐνη) (μ.ο. 2,4%), ενώ η τέφρα, το λίπος, η ολική και η πτητική οξύτητα καθώς και το pH ήταν μεγαλύτερα σε σχέση με το ΥΤΚ. Αντίθετα, το φαινολικό περιεχόμενο (30,3±3,0 mg GAE/g) και η αντιοξειδωτική ικανότητα (21,9±5,2 mg AAE/g) ήταν υψηλότερα, υποδεικνύοντας δυνατότητα χρησιμοποίησής του ως πρόσθετο σε τρόφιμα ή αφεψήματα με υψηλή αντιοξειδωτική δράση, ενώ αποτελεί καλό υπόστρωμα για μικροβιακή κατεργασία με στόχο την παραγωγή βιο-εμπλουτισμένων τροφίμων ή ζωοτροφών (π.χ., «συνβιοτικά» τρόφιμα). Από το ΥΤΚ παρασκευάστηκαν αρχικά 4 τύποι σιροπιών (πυκνότητας 38-40oBe), δύο «καστανά» και δύο «ξανθά», με τρυγία και με μερική απομάκρυνσή της. Όλα τα σιρόπια που παρασκευάσθηκαν είχαν παρόμοιο περιεχόμενο (% w/w) γλυκόζης (31,3-35,4%), φρουκτόζης (30,5-34,5%) και συνολικών σακχάρων (65,1-68,8%), και επιπλέον όλα περιείχαν ίχνη σακχαρόζης. Η ολική οξύτητα των σιροπιών ήταν παρόμοια. Επίσης, είχαν παραπλήσιες τιμές ολικού αζώτου, εκτός των ξανθών που είχαν μικρότερη περιεκτικότητα λόγω του τρόπου παραγωγής τους (διαύγαση και αποχρωματισμός). Η πτητική οξύτητα κυμάνθηκε σε χαμηλά επίπεδα (0,08-0,27% w/w), που αποτελεί ένδειξη ότι δεν υπέστησαν σημαντικές μικροβιακές αλλοιώσεις κατά την παρασκευή τους. Τα ξανθά σιρόπια είχαν υψηλότερη τιμή pH (~5,5-6,0) λόγω της μερικής καταβύθισης της τρυγίας. Το φαινολικό περιεχόμενο ήταν υψηλότερο στα καστανά σιρόπια (185-213 mg GAE/100 g), αφού στα ξανθά (134-143 mg GAE/100 g) απομακρύνθηκε ένα μέρος των φαινολικών ενώσεων και χρωστικών με ενεργό άνθρακα. Τα καστανά σιρόπια, όπως ήταν αναμενόμενο, εμφάνισαν μεγαλύτερη αντιοξειδωτική ικανότητα (0,90-1,0 mg ΑΑΕ/g) σε σχέση με τα ξανθά (0,29-0,58 mg ΑΑΕ/g). Όσον αφορά την διεργασία θείωσης των γλευκών για την παραγωγή των σιροπιών, προκύπτει πως πρέπει να προηγούνται εργαστηριακές δοκιμές ώστε να ρυθμίζεται η τελική ποσότητα SO2 που παραμένει στο προϊόν και να βρίσκονται τα προϊόντα εντός των επιθυμητών ορίων, αφού η στοιχειομετρικά υπολογισμένη ποσότητα οξειδωτικού (π.χ., Η2Ο2) δεν λειτουργεί λόγω της παρουσίας αντιοξειδωτικών ενώσεων στο ΥΤΚ. Βελτιώσεις στη θέμα αυτό μπορεί επίσης να αφορούν εφαρμογή τεχνικών αποστείρωσης του ΥΤΚ πριν την εκχύλιση και συμπύκνωση για αποφυγή της θείωσης των γλευκών. Συνολικά, ανιχνεύθηκαν με SPME GC-MS 144 πτητικές ενώσεις στα σιρόπια. Από αυτές, οι καρβονυλικές βρέθηκαν σε υψηλότερα επίπεδα στα σιρόπια σε σχέση το ΥΤΚ, με κυριότερες τις 2- και 3-μεθυλοβουτανάλη, ακετοΐνη, φουρφουράλη, 5-μεθυλο-2-φουρφουράλη, και 1-αιθυλο-2-φορμυλοπυρρόλη. Γενικά, οι περισσότερες από τις ενώσεις που ταυτοποιήθηκαν είτε παράγονται κατά την αφυδάτωση των σταφίδων ως προϊόντα οξείδωσης των λιπιδίων ή ως προϊόντα της αντίδρασης Maillard (καρβονυλικές ενώσεις, φουράνια, φουρφουρυλικές ενώσεις). Ωστόσο, σε κανένα από τα σιρόπια δεν ανιχνεύθηκε υδροξυμεθυλοφουρφουράλη (HMF) ή ακρυλαμίδιο, καθώς για την παρασκευή τους πραγματοποιήθηκε συμπύκνωση υπό κενό σε χαμηλή θερμοκρασία (45οC). Από τις οργανοληπτικές δοκιμές, τις μικροβιολογικές αναλύσεις, και τα επίπεδα πτητικής οξύτητας, φάνηκε πως τα σιρόπια από ΥΤΚ (με τις προτεινόμενες μεθόδους παρασκευής) είναι προϊόντα πολύ καλής ποιότητας, τα οποία διατηρούνται εύκολα, ενώ κατά τη διάρκεια παρασκευής και αποθήκευσής τους δεν εμφανίζουν μικροβιακές αλλοιώσεις. Γενικά περιγράφηκαν ως προϊόντα με έντονη επίγευση, καλή και όχι ιδιαίτερα έντονη οσμή, καλή γλυκόξινη γεύση ή παρόμοια με αυτή του μελιού, και χωρίς μεταλλική αίσθηση. Το χρώμα τους ήταν παρόμοιο με του μελιού για τα καστανά, και χρυσοκίτρινο για τα ξανθά σιρόπια. Τέλος, τα σιρόπια από ΥΤΚ, μπορούν να θεωρηθούν προϊόντα με υψηλή διατροφική αξία και κατάλληλα (με μέτρο) για διαβητικούς καθώς περιέχουν μεγάλο ποσοστό φρουκτόζης και καθόλου σακχαρόζη. Παρασκευάστηκαν επίσης μαρμελάδες από το ΥΤΚ με/χωρίς προσθήκη πηκτίνης και με/χωρίς συντηρητικά. Οι μαρμελάδες είχαν σε γενικές γραμμές παρόμοια χαρακτηριστικά με μαρμελάδα σταφυλιού του εμπορίου που χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση. Ορισμένες διαφορές μεταξύ τους οφείλονται στην διαφορετική πρώτη ύλη και τον διαφορετικό τρόπο παρασκευής τους. Όλες οι μαρμελάδες εμφάνισαν παρόμοιο φαινολικό περιεχόμενο (220-320 mg GAE/100 g, αθροιστικά υδατικού και οργανικού κλάσματος), ενώ η αντιοξειδωτική ικανότητα των μαρμελάδων ήταν 1,16-0,96 mg ΑΑΕ/g. Επίσης, ταυτοποιήθηκαν συνολικά 144 πτητικές ενώσεις με SPME GC-MS. Από αυτές, ορισμένες κατηγορίες όπως αλκοόλες, οργανικά οξέα, λακτόνες και υδρογονάνθρακες, ήταν κατά πολύ μειωμένες στη μαρμελάδα σε σχέση με την πρώτη ύλη (λόγω αραίωσης και απώλειας κατά το βρασμό). Όπως και στα σιρόπια, αυξημένα εμφανίστηκαν στις μαρμελάδες τα ποσοστά των καρβονυλικών ενώσεων (σχεδόν διπλάσια) και των τερπενίων (πιθανή υδρόλυση από τις δεσμευμένες μορφές τους). Από τις ενώσεις της αντίδρασης Maillard (εκτός από τις καρβονυλικές ενώσεις), ιδιαίτερα αυξημένο εμφανίστηκε στη μαρμελάδα το 2-ακετυλοφουράνιο. Πολύ μεγάλο ήταν επίσης το ποσοστό 2-οκτενάλης, ουσίας που υπάρχει στα σταφύλια και τις σταφίδες και είναι προϊόν της οξείδωσης των ακόρεστων λιπαρών οξέων από λιποξυγενάσες του σταφυλιού, αλλά και προϊόν της αντίδρασης Maillard. Επομένως δικαιολογείται η αυξημένη συγκέντρωσή της στη μαρμελάδα. Η διαφορές στο πτητικό προφίλ μεταξύ μαρμελάδων και σιροπιών εξαρτάται προφανώς από την διαφορετική θερμοκρασία και τον χρόνο της κατεργασίας. Από τις μικροβιολογικές αναλύσεις και τα επίπεδα πτητικής οξύτητας (0,044-0,066 %) φάνηκε πως οι μαρμελάδες είναι προϊόντα διατηρήσιμα. Το φαινολικό περιεχόμενό τους κυμάνθηκε στα ίδια επίπεδα με αυτά που αναφέρει η βιβλιογραφία, ενώ δεν περιείχαν ΗMF παρόλο που παρασκευάστηκαν με εντονότερη θερμική κατεργασία σε σχέση με τα σιρόπια. Γευστικά, αλλά και οπτικά, οι μαρμελάδες ήταν ευχάριστες και έγιναν καλά αποδεκτές από τους δοκιμαστές. Επίσης, φάνηκε πως δεν είναι απαραίτητη η προσθήκη συντηρητικών ή πηκτίνης καθώς οι μαρμελάδές χωρίς πρόσθετα είχαν παρόμοια υφή και διατηρησιμότητα με τις μαρμελάδες στις οποίες προστέθηκαν τα παραπάνω. Τέλος, μπορούν να θεωρηθούν προϊόντα με υψηλή διατροφική αξία και κατάλληλα για διαβητικούς (με μέτρο) καθώς δεν περιέχουν πρόσθετη ζάχαρη και η γλυκύτητά τους οφείλεται κατά το ήμισυ στη φρουκτόζη. Στη συνέχεια της διατριβής, μελετήθηκε η παραγωγή ξηρού οίνου από εκχυλίσματα ΥΤΚ σε διάφορες θερμοκρασίες (4, 10, 15, 22οC), με τη χρήση ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων του κρυοανθεκτικού και αλκοολοανθεκτικό στελέχους Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1, το οποίο έχει μελετηθεί εκτενώς για εφαρμογές σε ποτά, τρόφιμα και βιοκαύσιμα. Η χρήση τεχνικών ακινητοποίησης κυττάρων μπορεί να προσφέρει πλεονεκτήματα σε σύγκριση με συστήματα ελεύθερων κυττάρων, όπως αυξημένη παραγωγικότητα, αυξημένη βιωσιμότητα και λειτουργική σταθερότητα, δυνατότητα ζύμωσης σε χαμηλή θερμοκρασία, και βελτιωμένη ποιότητα προϊόντος. Συγκεκριμένα, ο συνδυασμός ακινητοποίησης κυττάρων και η ζύμωση σε εξαιρετικά χαμηλή θερμοκρασία συμβάλει στη βελτίωση της ποιότητας των προϊόντων τόσο της αλκοολικής όσο και της οξικής ζύμωσης, όπως έχει φανεί από πληθώρα προηγούμενων μελετών. Η θερμοκρασία επηρέασε επίσης σημαντικά τον χρόνο ζύμωσης των ξηρών οίνων, ενώ δεν επηρέασε σημαντικά τα επίπεδα αζύμωτου σακχάρου, αιθανόλης, ολικής και πτητικής οξύτητας. Ο βιοκαταλύτης διατήρησε τη λειτουργική του σταθερότητα για περισσότερο από 6 εβδομάδες, ακόμη και στους 4oC. Οι οίνοι ήταν πιο διαυγείς από εκείνους που παρασκευάστηκαν με ελεύθερα κύτταρα, περιείχαν ίχνη αζύμωτου σακχάρου και η περιεκτικότητα σε αιθανόλη κυμάνθηκε στα 11,2%. Επίσης, δεν ανιχνεύθηκε μεθανόλη, που σημαίνει ότι η πηκτινομεθυλεστεράση του σταφυλιού είχε απενεργοποιηθεί κατά την αφυδάτωση των σταφίδων. Η μη ύπαρξη μεθανόλης καθιστά τους ξηρούς οίνους ιδανική πρώτη ύλη για την παραγωγή αποσταγμάτων, που μπορεί να αποφέρει ακόμα μεγαλύτερη προστιθέμενη αξία στο ΥΤΚ. Επομένως, μελλοντική μελέτη της παραγωγής αποσταγμάτων από το ΥΤΚ (τύπου «μπράντι σταφίδας») προτείνεται εντόνως. Το pΗ των ξηρών οίνων που παράχθηκαν με ακινητοποιημένα κύτταρα ήταν ελαφρώς χαμηλότερο, αν και η ολική και η πτητική οξύτητα ήταν ελαφρώς υψηλότερες στους οίνους που παρασκευάστηκαν με ελεύθερα κύτταρα. Ωστόσο, οι παρατηρούμενες μεταβολές ήταν στατιστικά ασήμαντες. Το ίδιο παρατηρήθηκε για τα επιμέρους οργανικά οξέα, εκτός του ηλεκτρικού, το οποίο ήταν πιο άφθονο στους οίνους που παράχθηκαν με ακινητοποιημένα κύτταρα. Το φαινολικό περιεχόμενο ήταν σε ελαφρώς χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τους περισσότερους λευκούς οίνους. Επομένως, προτείνεται βελτιστοποίηση της εκχύλισης του ΥΤΚ για την παραλαβή περισσότερων φαινολικών συστατικών. Επίσης, μειώθηκε σε χαμηλότερες θερμοκρασίες ζύμωσης με τη χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων. Αυτό μπορεί να αποτελεί μειονέκτημα όσον αφορά την διατροφική αξία του οίνου, αλλά όχι απαραίτητα και τεχνολογικό μειονέκτημα δεδομένου ότι τα φαινολικά συστατικά επηρεάζουν τη γεύση, το άρωμα και τη διαύγεια των οίνων, και η τελική ποιότητα θα εξαρτηθεί από το σύνολο των πρακτικών οινοποίησης που θα εφαρμοστούν (θερμοκρασία ζύμωσης, χρήση ή μη ακινητοποιημένων κυττάρων, κατεργασίες διαύγασης, και άλλες μεταζυμωτικές κατεργασίες). Τα επιμέρους φαινολικά συστατικά στους οίνους που παρασκευάστηκαν με τη χρήση ακινητοποιημένων κύτταρων, και προσδιορίστηκαν με RP-HPLC, ήταν το γαλλικό, το βανιλλικό, το π-κουμαρικό και το καφεϊκό οξύ. Παρόμοια μείωση σε χαμηλότερες θερμοκρασίες ζύμωσης παρατηρήθηκε και για αυτές τις ενώσεις. Το βανιλλικό οξύ ήταν το κύριο φαινολικό οξύ στους οίνους που παρασκευάστηκαν στους 22οC. Στους ξηρούς οίνους ταυτοποιήθηκαν συνολικά 160 πτητικές ενώσεις. Συγκεκριμένα οι οίνοι περιείχαν υψηλότερα επίπεδα τερπενίων από το ΥΤΚ (που υποδεικνύει υδρόλυση συνδεδεμένων μορφών τους στους οίνους), και μεγάλο αριθμό πτητικών ενώσεων (κυρίως εστέρες) που προέρχονται από τη ζύμωση. Η επίδραση της ακινητοποίησης του ζυμομύκητα στο πτητικό προφίλ των οίνων ήταν η αναμενόμενη, όπως αναφέρεται και σε προηγούμενες μελέτες (υψηλότερα επίπεδα εστέρων σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα, και σε χαμηλότερη θερμοκρασία ζύμωσης). Ο οίνος που παρασκευάστηκε με ακινητοποιημένα κύτταρα είχε επίσης μεγαλύτερη διαύγεια και χωρίς την παρουσία θολωμάτων. Επίσης, η ένταση του χρώματος χαρακτηρίστηκε από ωχρή έως μέτρια, και η απόχρωση ήταν ανοιχτή, του κεχριμπαριού. Όσο αναφορά το άρωμα, παρατηρήθηκε μέτρια ένταση και στους δύο οίνους. Γενικά οι οίνοι χαρακτηρίστηκαν ως ξηροί, με χαμηλή τανίνη, ελαφρύ σώμα, και μέτριας έντασης γεύση, οξύτητα και επίγευση. Η αίσθηση της αλκοόλης ήταν μέτρια για τους δύο οίνους που δοκιμάστηκαν. Παρασκευάστηκαν επίσης τρεις τύποι γλυκών οίνων με αλκοόλη ~15,5% v/v. Ένας οίνος παρασκευάστηκε με προσθήκη πόσιμης αιθανόλης για παύση της αλκοολικής ζύμωσης. Οι άλλοι δύο οίνοι παρασκευάστηκαν με πλήρη ζύμωση και στη συνέχεια προσθήκη ΥΤΚ ή προσθήκη καστανού σιροπιού από ΥΤΚ για την επίτευξη της επιθυμητής γλυκύτητας. Τα περισσότερα χαρακτηριστικά τους ήταν παρόμοια με εκείνα γλυκών κρασιών του εμπορίου. Η ολική οξύτητα κυμάνθηκε περίπου στα 7 g τρυγικού οξέος/l με μεγαλύτερη οξύτητα να παρουσιάζουν οι οίνοι στους οποίους προστέθηκε ΥΤΚ ή σιρόπι. Η δε πτητική οξύτητα και το pH των οίνων ήταν χαμηλά και για τους τρεις οίνους. Τα κύρια οργανικά οξέα των οίνων ήταν το τρυγικό και μηλικό οξύ, ενώ περιείχαν πολύ μικρότερες συγκεντρώσεις κιτρικού, οξικού και ηλεκτρικού οξέος. Όλοι οι οίνοι εμφάνισαν παρόμοιες τιμές φαινολικού περιεχομένου (244-325 mg GAE/l) και αντιοξειδωτικής ικανότητας. Στους γλυκούς οίνους ταυτοποιήθηκαν 160 πτητικές ενώσεις, όπως και στους ξηρούς. Σχετικά με την εμφάνιση, και για τους τρεις οίνους παρατηρήθηκε υψηλή διαύγεια, χωρίς ιζήματα. Η ένταση των χρωμάτων χαρακτηρίστηκε ως έντονη με αποχρώσεις του ανοιχτού καφέ-πορτοκαλί έως σκούρου-κεχριμπαρί χρώματος. Περιγράφηκαν γενικά ως οίνοι υψηλής γλυκύτητας, μέτριας οξύτητας, με έντονη γεύση σταφίδας, και επίγευση αρκετή αλλά όχι μακρά. Η αίσθηση της αλκοόλης ήταν μέτρια έως υψηλή και για τα τρία κρασιά που δοκιμάστηκαν. Συμπερασματικά, οι γλυκοί οίνοι που παρασκευάστηκαν με τις προτεινόμενες μεθόδους, ομοιάζουν με τους επιτραπέζιους γλυκούς οίνους με μόνη διαφορά τα χαμηλότερα επίπεδα φαινολικού περιεχομένου και αντιοξειδωτικής ικανότητας, σύμφωνα με τη διαθέσιμη βιβλιογραφία, αφού δεν πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις σε οίνους του εμπορίου με τις αναλυτικές τεχνικές που εφαρμόστηκαν στη διατριβή. Οι προτεινόμενες μέθοδοι όμως οδήγησαν σε οίνους πολύ καλής οργανοληπτικής ποιότητας, που μπορούν όλοι να τυποποιηθούν και να καταναλωθούν ως γευστικά ηδύποτα από σταφίδα, ενώ παράλληλα μπορούν να μειώσουν σημαντικά το κόστος παραγωγής καθώς δεν απαιτείται προσθήκη πόσιμης αιθανόλης. Στη συνέχεια της διατριβής πραγματοποιήθηκε παραγωγή ξυδιού με οξική ζύμωση γλυκού οίνου από ΥΤΚ με τη χρήση ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων άγριας μαγιάς, αλλά και μικτής καλλιέργειας επιλεγμένων οξικών βακτηρίων. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε ένα βακτήριο «γρήγορης εκκίνησης» (Acetobacter aceti DSM 3508) και ένα βακτήριο με υψηλή αντοχή στο οξικό οξύ (Komagataeibacter europareus DSM 6160). Παράλληλα μελετήθηκε των οξοποιητικών καλλιεργειών μετά από παραμονή σε χαμηλή θερμοκρασία για 2 μήνες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε όλες τις περιπτώσεις ο χρόνος οξοποίησης μειώνεται ελαφρώς από παρτίδα σε παρτίδα (προσαρμογή των κυττάρων και λειτουργική σταθερότητα του συστήματος), και σημαντικά με τη χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων (αύξηση παραγωγικότητας-μείωση κόστους διεργασίας). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες όσον αφορά την αύξηση της ταχύτητας και παραγωγικότητας που προκαλεί η ακινητοποίηση κυττάρων σε άλλες ζυμωτικές διεργασίες, όπως η αλκοολική και η γαλακτική ζύμωση. Η δε παραμονή της οξικής καλλιέργειας σε χαμηλή θερμοκρασία στο ψυγείο δεν την απενεργοποιεί πλήρως, όμως αυξάνει τον χρόνο της επόμενης οξοποίησης. Η χρήση της μικτής καλλιέργειας επιλεγμένων οξικών βακτηρίων, είχε επίσης ως αποτέλεσμα τη μείωση του χρόνου οξοποίησης, σε σχέση με την άγρια μαγιά οξοποίησης, εξασφαλίζοντας έτσι καλύτερες αποδόσεις και καλύτερη εξέλιξη των ζυμώσεων. Το φαινολικό περιεχόμενο και η αντιοξειδωτική ικανότητα ήταν υψηλότερα στην περίπτωση του ξυδιού που παρασκευάστηκε με ελεύθερα κύτταρα (λόγω προσρόφησης φαινολικών ενώσεων στον φορέα ακινητοποίησης), ωστόσο κυμάνθηκε σε παρόμοια επίπεδα με τα εμπορικά προϊόντα ξυδιού από λευκό κρασί. Συγκρίνοντας τα διάφορα προϊόντα ξυδιού μεταξύ τους όσον αφορά το πτητικό προφίλ, παρατηρείται πως μεγαλύτερα ποσοστά εστέρων περιείχαν τα προϊόντα που παρασκευάστηκαν με ακινητοποιημένα κύτταρα. Επίσης, οι εστέρες στα προϊόντα ήταν κατά 8 φορές αυξημένοι σε σχέση με το ΥΤΚ. Μεγαλύτερα ποσοστά αλκοολών περιείχε το ξύδι που παρασκευάστηκε με ελεύθερα κύτταρα της άγριας μαγιάς. Τα ποσοστά οργανικών οξέων ήταν παρόμοια στα περισσότερα δείγματα, εκτός του ξυδιού που παρασκευάστηκε με ελεύθερα κύτταρα των επιλεγμένων οξικών βακτηρίων. Επίσης, τα προϊόντα παρουσίασαν μειωμένα ποσοστά τερπενίων, λακτονών και καρβονυλικών ενώσεων σε σχέση με το ΥΤΚ. Τα αποτελέσματα συγκεντρωτικά είναι ενθαρρυντικά για την παραγωγή ξυδιού από το ΥΤΚ με ακινητοποιημένα κύτταρα επιλεγμένων οξικών βακτηρίων, με την προϋπόθεση ότι η εφαρμογή στη βιομηχανία θα εμπλέκει εξειδικευμένο προσωπικό, καθώς και τις κατάλληλες μεταζυμωτικές κατεργασίες. Στην παρούσα διατριβή προτείνεται επίσης η χρήση του ΥΤΚ ως πρώτη ύλη για την παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης (ΒΚ), η οποία αν και προσεγγίζεται ως υλικό με ποικίλες εφαρμογές (εξ’ ου και μελετήθηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες υφής της), μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως τρόφιμο υψηλής διατροφικής αξίας (πλούσιο σε διαιτητικές ίνες/πριβιοτικό τρόφιμο). Συγκεκριμένα, από τα αποτελέσματα της μελέτης βελτιστοποίησης παραγωγής ΒΚ με τον μικροοργανισμό Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 σε εκχυλίσματα ΥΤΚ (ΕΥΤΚ) (με Μεθοδολογία Επιφανειακής Απόκρισης με βάση τον Σύνθετο Κεντρικό Σχεδιασμό), προκύπτει ότι η προσθήκη πηγών-Ν στο ΕΥΤΚ είναι απαραίτητη για βέλτιστη απόδοση σε ΒΚ. Σημαντικό ρόλο στην απόδοση έπαιξαν επίσης το pH και η θερμοκρασία επώασης. Ο ιδανικός συνδυασμός για τη βέλτιστη απόδοση ΒΚ σε ΕΥΤΚ ήταν 28,07οC, pH 6,42, συγκέντρωση σακχάρου 46,24 g/l και προσθήκη δύο πηγών-Ν (πεπτόνη και yeast extract), αποδίδοντας 18,40,6 g/l ΒΚ. Χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα μίγμα ΕΥΤΚ/τυρογάλακτος, ο ιδανικός συνδυασμός για τη βέλτιστη απόδοση ΒΚ ήταν pH 6,36 και προσθήκη yeast extract 1,7%, οδηγώντας σε παραγωγή 18,9±0,7 g/l ΒΚ. Επομένως το τυρόγαλα μπορεί να αξιοποιηθεί από τον Κ. sucrofermentans ως φθηνή πηγή-Ν και άλλων μικροθρεπτικών συστατικών για την παραγωγή ΒΚ. Επίσης, ο τρόπος ξήρανσης της ΒΚ μετά την παραγωγή της (θερμική, freeze-drying) οδηγεί σε διάφορες μορφές και υφές του προϊόντος (διαυγές φιλμ με πολυμερική εμφάνιση και υφή, με μεγάλη διαπερατότητα και ολκιμότητα, ή υφή παρόμοια με χαρτιού ή του βαμβακιού). Η φυσικοχημική ανάλυση υφής (ποροσιμετρία, SEM, FT-IR, XRD, TGA/TDA), έδειξε ότι η ΒΚ αποτελείται από διασταυρωμένες, αλλά με σχετικά υψηλό βαθμό προσανατολισμού ίνες (με πάχος στη νανοκλίμακα), που δημιουργούν μία δομή πυκνού τρισδιάστατου δικτύου, ενώ ο όγκος των πόρων της είναι παρόμοιος ή μεγαλύτερος από άλλα είδη φυτικής απολιγνινοποιημένης κυτταρίνης. Τέλος, τα ΕΥΤΚ χαμηλότερης πυκνότητας που απομένουν από την παραγωγή των παραπάνω προϊόντων, χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή μικροβιακής βιομάζας. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η παραγωγή μαγιάς αρτοποιίας ή οινοποίησης (S. cerevisiae). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έντονη παροχή αέρα και η προσθήκη πηγής-Ν είναι απαραίτητες για την αύξηση της απόδοσης παραγωγής της βιομάζας στα ΕΥΤΚ. Η δε προσθήκη θρεπτικών συμπληρωμάτων Ν, P, S και Mg (υπό μορφή ανόργανων αλάτων τους), περαιτέρω αυξάνουν την απόδοση. Η μέγιστη απόδοση κυτταρικής βιομάζας που επιτεύχθηκε ήταν 45,0±1,3 g/l και 40,9±2,5 g/l ΕΥΤΚ, μαγιάς αρτοποιίας και S. cerevisiaie AXAZ-1, αντίστοιχα. Η βιωσιμότητα της παραγόμενης μαγιάς αρτοποιίας εξετάστηκε σε διάστημα 3 μηνών και βρέθηκε ικανοποιητική, ενώ η σύστασή της ήταν παρόμοια με της μαγιάς αρτοποιίας του εμπορίου που χρησιμοποιήθηκε ως εμβόλιο. Η τεχνοοικονομική ανάλυση για μια ολοκληρωμένη βιομηχανική διεργασία παραγωγής οίνου (με ακινητοποιημένα κύτταρα) (780 m3/έτος) και μαγιάς αρτοποιίας (24,6 tn/έτος) με πρώτη ύλη το ΥΤΚ (7,5 m3/ημέρα, για 120 ημέρες/έτος) έδειξε ότι η επένδυση είναι ρεαλιστική και συμφέρουσα. Για μηδενική Καθαρή Παρούσα Αξία (NPV), η Ελάχιστη Τιμή Πώλησης (MSP) εκτιμάται σε 7,75 $/tn αθροιστικά για τον ξηρό οίνο και τη μαγιά αρτοποιίας, δηλαδή 0,08 $/kg προϊόντος. Στο τέλος του πονήματος, παρατίθενται τα συμπεράσματα επί των αποτελεσμάτων της διατριβής, από τα οποία προκύπτει ότι το ΥΤΚ αποτελεί μια πρώτη ύλη με υψηλή διατροφική αξία, κατάλληλη για χρήση ως πρώτη ύλη για πληθώρα προϊόντων όπως οίνοι, σιρόπια, μαρμελάδες, ξύδι, μικροβιακοί μεταβολίτες και μικροβιακή βιομάζα. Η τεχνική της ακινητοποίησης κυττάρων βοήθησε σε κάθε περίπτωση τόσο στην ποιότητα των τελικών προϊόντων ζύμωσης όσο και στην αποδοτικότητα των διεργασιών. Οι νέες μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή γλυκών οίνων και γλυκαντικών υλών είναι κατάλληλες για την παραγωγή προϊόντων καλής ποιότητας και με χαμηλό κόστος παραγωγής. Τέλος, προτείνονται μελλοντικές δράσεις για την διόρθωση της ποιότητας των προτεινομένων προϊόντων και των μεθόδων παρασκευής τους, την παραγωγή επιπλέον προϊόντων από το ΥΤΚ, και την αξιολόγηση της πιθανής βιομηχανικής τους εφαρμογής, με σκοπό την αξιοποίηση όλης της ποσότητας του ΥΤΚ και την παραγωγή προστιθέμενης αξίας, υπό την ιδέα του βιοδιυλιστηρίου.