In vitro διερεύνηση της αντικαρκινικής δράσης αυτόλογων κυτταρικών κυστιδίων φορτωμένων με δοξορουβικίνη κατά του τριπλά αρνητικού καρκίνου του μαστού

• Κύριος συγγραφέας: Σωτηροπούλου, Παρασκευή
• Άλλοι συγγραφείς: Sotiropoulou, Paraskevi
• Γλώσσα: Greek
• Έκδοση: 2021
• Θέματα: Κυτταρικά κυστίδια; Καρκίνος του μαστού; Δοξορουβικίνη; Λιποσώματα; Cellular vesicles; Breast cancer; Doxorubicin; Liposomes

Τα λιποσώματα είναι σφαιρικά κυστίδια αποτελούμενα από φυσικά ή τεχνητά λιπίδια, που βρίσκουν εφαρμογή στη φαρμακευτική ως νανοφορείς φαρμακευτικών ενώσεων. Παρουσιάζουν ποικίλα πλεονεκτήματα, καθώς προστατεύουν τις βιοδραστικές ουσίες, τις απελευθερώνουν ελεγχόμενα, στοχεύουν λόγω του μικρού μεγέθους τους παθητικά τους όγκους μέσω του φαινομένου αυξημένης διαπερατότητας και συγκράτησης, βελτιώνουν τη μεταφορά δυσδιάλυτων ενώσεων και μεταφέρουν υδρόφιλα, λιπόφιλα και αμφίφιλα μόρια. Για τους λόγους αυτούς, έχουν εγκριθεί ορισμένα λιποσωμικά σκευάσματα που πλεονεκτούν συγκριτικά με τα συμβατικά ως προς τη φαρμακοκινητική τους. Ανάμεσα σε αυτά είναι και η λιποσωμική δοξορουβικίνη που βρίσκει εφαρμογή στη χημειοθεραπεία διαφόρων όγκων, όπως του καρκίνου του μαστού. Παρ’ όλα αυτά, τα λιποσωμικά σκευάσματα, μέχρι σήμερα, δεν εμφανίζουν ενεργό στόχευση στον επιθυμητό ιστό. Έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες για σύνδεση κατάλληλων προσδετών στην επιφάνειά τους, όμως καμία από αυτές δεν έχει καταλήξει στην έγκριση ενός τέτοιου σκευάσματος. Εναλλακτικοί νανοφορείς που στοχεύουν ενεργά συγκεκριμένους ιστούς, χωρίς να απαιτείται τροποποίηση της επιφάνειάς τους, είναι τα κυτταρικά κυστίδια. Αυτά, προκύπτουν από την επεξεργασία κυττάρων με φυσικές μεθόδους, διατηρώντας τη λιπιδική και πρωτεϊνική σύσταση των κυττάρων από τα οποία προέρχονται, γεγονός που τους επιτρέπει να εμφανίζουν στοχευμένη δράση. Τα κυτταρικά κυστίδια, είναι ουσιαστικά βιο- εμπνευσμένοι μιμητές των εξωσωμάτων, των οποίων η κύρια λειτουργία είναι η διεκπεραίωση της κυτταρικής επικοινωνίας. Όμως, η απομόνωσή τους είναι δύσκολη και για αυτό χρησιμοποιούνται κυτταρικά κυστίδια που πλεονεκτούν σε αυτόν τον τομέα και διατηρούν το φαινόμενο του in vivo οργανοτροπισμού. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η αξιολόγηση τριών διαφορετικών κυτταρικών κυστιδίων απομονωμένων από κυτταρικές σειρές του καρκίνου του μαστού ως φορείς δοξορουβικίνης κατά του καρκίνου του μαστού. Οι κυτταρικές σειρές που επιλέχθηκαν ήταν η 4Τ1, η MDA-MB-231 και η MCF-7. Οι δύο πρώτες αποτελούνται από κύτταρα του τριπλά αρνητικού καρκίνου του μαστού, από ποντικό και άνθρωπο αντίστοιχα, ενώ η τρίτη αποτελείται από ανθρώπινα κύτταρα μαστού αρνητικά μόνο για την πρωτεΐνη HER2. Τα κυστίδια απομονώθηκαν μέσω εξώθησης των αντίστοιχων κυττάρων από πολυανθρακικές μεμβράνες και μαζί με αρνητικά φορτισμένα λιποσώματα που χρησιμοποιήθηκαν ως αναφορά, χαρακτηρίστηκαν φυσικοχημικά και μελετήθηκε η πρόσληψή τους στις καρκινικές σειρές και σε φυσιολογική σειρά κυττάρων του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (hCMEC) μέσω σήμανσής τους με φθορίζουσα ουσία. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε ο μηχανισμός ενδοκυττάρωσής τους με τη χρήση αναστολέων των μονοπατιών κλαθρίνης και καβεολίνης και το αν διαπερνούν τις μεμβράνες παθητικά. Ακολούθως, ενσωμάτωσαν δοξορουβικίνη με ενεργό φόρτωση, και μελετήθηκε η τοξικότητά τους στις καρκινικές σειρές και στα φυσιολογικά κύτταρα HEK293. Τέλος, υπολογίστηκε το ποσοστό απελευθέρωσης δοξορουβικίνης από τους φορείς παρουσία PBS και FBS σε διάστημα 48h. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κυτταρικά κυστίδια πλεονεκτούν των λιποσωμάτων, καθώς διατηρούν τις επιθυμητές ιδιότητές τους και επιπρόσθετα στοχεύουν ενεργά τα καρκινικά κύτταρα. Πιο αναλυτικά, τα κυτταρικά κυστίδια έχουν διάμετρο της τάξης των νανομέτρων, όπως και τα λιποσώματα, και τα πειράματα πρόσληψης έδειξαν ότι προσλαμβάνονται σε πολλαπλάσιο ποσοστό σε σχέση με τα λιποσώματα από τα καρκινικά κύτταρα. Μάλιστα, την καλύτερη στόχευση σε κάθε καρκινική σειρά επιτυγχάνουν τα αυτόλογα κυστίδια. Επίσης, τα κυστίδια μπορούν να διαπεράσουν βιολογικούς φραγμούς, αν και σε μικρότερο ποσοστό από ότι διαπερνούν τα καρκινικά κύτταρα, και συνεπώς να βρουν εφαρμογή σε τοπικούς όγκους, πρωτοπαθείς ή μεταστατικούς. Έτσι, επιβεβαιώθηκε η ικανότητα ενεργούς στόχευσης των κυστιδίων λόγω των πρωτεϊνών που διαθέτουν. Η διερεύνηση των μηχανισμών ενδοκυττάρωσης έδειξε ότι τα λιποσώματα ενδοκυτταρώνονται μέσω κλαθρίνης και καβεολίνης αλλά και παθητικά, ενώ τα κυστίδια κυρίως μέσω καβεολίνης. Τα πειράματα τοξικότητας έδειξαν ότι οι κενοί φορείς δεν είναι τοξικοί και ότι οι φορτωμένοι με φάρμακο φορείς παρουσιάζουν τη μικρότερη τοξικότητα στα φυσιολογικά κύτταρα, προστατεύοντάς τα και βελτιώνοντας το τοξικολογικό προφίλ της δοξορουβικίνης. Σε κάθε καρκινική σειρά, τη μεγαλύτερη τοξικότητα εμφανίζουν τα αυτόλογα κυστίδια, επιβεβαιώνοντας τα πειράματα πρόσληψης. Τέλος, το πείραμα απελευθέρωσης δοξορουβικίνης απέδειξε ότι τα κυστίδια συγκρατούν το φάρμακο και το απελευθερώνουν σε διάστημα αρκετών ωρών. Τα κυστίδια είναι λίγο πιο σταθερά στο FBS, ενώ τα λιποσώματα είναι αρκετά πιο σταθερά στο PBS.