Λειτουργική γονιδιωματική ανάλυση T-box ριβοδιακοπτών από παθογόνα βακτήρια

• Main Author: Ιωάννα, Πατσή
• Other Authors: Ioanna, Patsi
• Language: Greek
• Published: 2021
• Subjects: Τ-box ριβοδιακόπτης; Μεταφορικό RNA; RNA ρυθμιστικοί μηχανισμοί; Ρύθμιση μεταγραφής; T-box riboswitch; tRNA; Transcription regulation

Οι T-box ριβοδιακόπτες αποτελούν μια κατηγορία ρυθμιστικών tRNA-εξαρτώμενων, μη κωδικών μορίων RNA τα οποία εδράζονται στην 5’UTR των μορίων mRNA και είναι ευρέως κατανεμημένα στα Gram θετικά παθογόνα βακτήρια. Oι T-box ριβοδιακόπτες μπορούν να αλληλοεπιδρούν με μόρια tRNA τα οποία μπορεί να είναι αμινοακυλιωμένα ή μη. Τα αμινοακυλιωμένα μόρια tRNA δρουν ανταγωνιστικά στην πρόσδεση των μη αμινοακυλιωμένων tRNA και η αναλογία τους είναι αυτή που οδηγεί στην μεταγραφή ή στον τερματισμό της μεταγραφής των γονιδίων που βρίσκονται καθοδικά. Η πλειοψηφία των γονιδίων που ελέγχονται από Τ-box ριβοδιακόπτες κωδικοποιούν κυρίως αμινοάκυλο-tRNA συνθετάσες και ένζυμα που συμμετέχουν στη βιοσύνθεση και στη μεταφορά αμινοξέων. Μέχρι σήμερα ο αριθμός των χαρακτηρισμένων T-box ριβοδιακοπτών που ανήκουν σε παθογόνα βακτήρια παραμένει περιορισμένος. Βάσει αυτού, επιλέχθηκαν τέσσερεις νέοι, μη χαρακτηρισμένοι, glyQ T-box ριβοδιακόπτες οι οποίοι ανήκουν σε παθογόνα βακτήρια. Η παρούσα εργασία επικεντρώθηκε στον χαρακτηρισμό των glyQ T-box ριβοδιακοπτών των βακτηρίων L. monocytogenes, C. tetani, S. pneumoniae και S. pyogenes. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν οι κατάλληλες βιοπληροφορικές αναλύσεις από τις οποίες προέκυψαν οι πιθανές δευτεροταγείς δομές των ριβοδιακοπτών και οι πιθανές δομικές τους διαφοροποιήσεις. Με σκοπό την διερεύνηση της λειτουργία τους καθενός πραγματοποιήθηκαν τόσο in vitro όσο και in vivo μελέτες. Η μελέτη αυτή συμπεριλάμβανε την διεκπεραίωση δοκιμών αλλαγής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA) και χρήσης ενός in vivo συστήματος μέσω του οποίου ήταν εφικτή η άμεση μέτρηση των επιπέδων της μεταγραφής στην T-box μεσολαβούμενη μεταγραφή. Στις in vivo δοκιμές αντι-τερματισμού χρησιμοποιήθηκε το tRNAGly του B. subtilis, το οποίο εμφανίζει και την μεγαλύτερη συγγένεια με τα αντίστοιχα tRNAGly των τεσσάρων βακτηρίων. Οι βιοπληροφορικές αναλύσεις έδειξαν ότι οι δευτεροταγείς δομές των L. monocytogenes και C. tetani δεν αποκλίνουν ιδιαίτερα από το μοτίβο που παρουσιάζει ο αντίστοιχος T-box ριβοδιακόπτης του B. subtilis. Αντιθέτως, οι στρεπτόκοκκοι παρουσιάζουν διαφοροποιήσεις και ιδίως ο S. pyogenes o οποίος έχει μια εκτεταμένη μήκους οδηγό αλληλουχία και, πιθανών, ένα στέλεχος ΙΙ. Oι in vivo δοκιμές αντι-τερματισμού ανέδειξαν ως πιο αποδοτικό τπν ριβοδιακόπτη του L. monocytogenes με μικρή διαφορά σε σχέση με ριβοδιακόπτη του S. pneumoniae. Tην πιο μειωμένη απόδοση παρουσίασε ο T-box ριβοδιακόπτης του C. tetani ενώ αυτός του S. pyogenes ήταν σε ελαφρώς χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τους δύο προαναφερθέντες ριβοδιακόπτες.