Συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος
Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό πρωτεϊνών φαρμακευτικού (ινσουλίνη, ιικές πρωτεΐνες) και βιοτεχνολογικού (TtPPO πολυφαινολοξειδάση) ενδιαφέροντος, καθώς και στην ανάπτυξη πρωτοκόλλων για την αξιολόγηση της σταθερότητας μικρο...
| Κύριος συγγραφέας: | |
|---|---|
| Άλλοι συγγραφείς: | |
| Γλώσσα: | Greek |
| Έκδοση: |
2021
|
| Θέματα: | |
| Διαθέσιμο Online: | http://hdl.handle.net/10889/15630 |
| id |
nemertes-10889-15630 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
UPatras |
| collection |
Nemertes |
| language |
Greek |
| topic |
Κρυσταλλογραφία Δομική βιολογία Βιοχημεία Ακτινοβολία σύγχροτρον Ιικές πρωτεΐνες Ινσουλίνη Σχετική υγρασία Πολυφαινολοξειδάσες Διαβήτης Δάγκειος ιός Ιός κοξάκι Σχεδιασμός φαρμάκων Crystallography Structural biology Biochemistry Synchrotron radiation Virus proteins Insulin Relative humidity Polyphenol oxidases Diabetes Dengue virus Coxsackie virus Drug design |
| spellingShingle |
Κρυσταλλογραφία Δομική βιολογία Βιοχημεία Ακτινοβολία σύγχροτρον Ιικές πρωτεΐνες Ινσουλίνη Σχετική υγρασία Πολυφαινολοξειδάσες Διαβήτης Δάγκειος ιός Ιός κοξάκι Σχεδιασμός φαρμάκων Crystallography Structural biology Biochemistry Synchrotron radiation Virus proteins Insulin Relative humidity Polyphenol oxidases Diabetes Dengue virus Coxsackie virus Drug design Βαλμάς, Αλέξανδρος Συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος |
| description |
Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό πρωτεϊνών φαρμακευτικού (ινσουλίνη, ιικές πρωτεΐνες) και βιοτεχνολογικού (TtPPO πολυφαινολοξειδάση) ενδιαφέροντος, καθώς και στην ανάπτυξη πρωτοκόλλων για την αξιολόγηση της σταθερότητας μικροκρυστάλλων μακρομορίων σε μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες.
Σχετικά με την ανθρώπινη ινσουλίνη, πραγματοποιήθηκε μια ενδελεχής μελέτη του πολυμορφισμού (κρυσταλλικού και μοριακού), παρουσία τριών οργανικών μορίων-προσδετών (4-ethylresorcinol, m-nitrophenol και p-coumaric acid), συναρτήσει του pH (8ο κεφάλαιο). Η δομική συμπεριφορά του μορίου καταγράφηκε τόσο μέσω πειραμάτων περίθλασης ακτίνων-Χ από πολυκρυσταλλικά υλικά (XRPD) όσο και με πειράματα περίθλασης από μονοκρύσταλλο (SCXD). Εντοπίσθηκαν τέσσερα πολύμορφα μονοκλινούς συμμετρίας, δύο εκ των οποίων δεν έχουν καταγραφεί έως τώρα ξανά βιβλιογραφικά, ενώ εξετάζονται επίσης οι μεταξύ τους μεταβάσεις κρυσταλλικών φάσεων. Ένα από τα νέα μονοκλινή πολύμορφα, χαρακτηρίζεται από το πυκνότερο έως τώρα καταγεγραμμένο πακετάρισμα μορίων ινσουλίνης (ανάμεσα στα γνωστά μονοκλινή πολύμορφα στο ίδιο space group), με την ιδιαίτερη μοριακή του δομή να αποσαφηνίζεται μέσω πειραμάτων SCXD, παρέχοντας πληροφορίες που μπορούν δυνητικά να έχουν ιδιαίτερο φαρμακευτικό ενδιαφέρον.
Πρωτεϊνικά μόρια με κομβικό ρόλο κατά τη διάρκεια του ιικού κύκλου ζωής, έχουν χαρακτηριστεί ως στόχοι κατάλληλοι για την ανάπτυξη αντιικών σκευασμάτων. Στο 9ο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής αναλύεται η έκφραση, απομόνωση, κρυστάλλωση, δομικός χαρακτηρισμός καθώς και πρωταρχικά πειράματα εντοπισμού μορίων-αναστολέων (fragment screening) για δυο ιικές πρωτεΐνες: H πρωτεΐνη 3Cpro, η κύρια πρωτεάση του ιού Coxsackie B3, υπεύθυνου για πολυάριθμα περιστατικά μυοκαρδίτιδας παγκοσμίως, και της επικράτειας μεθυλτρανσφεράσης (MTase domain) της μη δομικής πρωτεΐνης 5 (NS5) του ορότυπου 3 του ιού Dengue. Πολυκρυσταλλικά δείγματα κατάλληλα για μετρήσεις XRPD παρήχθησαν και για τις δυο πρωτεΐνες, ενώ ακολούθησε ο πρωταρχικός δομικός χαρακτηρισμός των μικροκρυστάλλων στο επίπεδο της μοναδιαίας κυψελίδας. Για την περίπτωση της 3Cpro και με τη χρήση μονοκρυστάλλων, διεξήχθη, τέλος, ένα πλήρες πείραμα για τον εντοπισμό χημικών θραυσμάτων-δυνητικών αναστολέων (fragment screening) έναντι του συγκεκριμένου μορίου.
Το 10ο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής ερευνά το πώς μεταβολές περιβαλλοντικών παραγόντων όπως η σχετική υγρασία (rH) επηρεάζουν την εσωτερική οργάνωση των πρωτεϊνικών κρυστάλλων, που αποτελούνται από υψηλό ποσοστό διαλύτη. Η αναδιοργάνωση των μορίων που παρατηρείται στις περιπτώσεις αυτές μπορεί να καταγραφεί σε διακριτά προφίλ περίθλασης. Στο κεφάλαιο αυτό καταγράφεται η συμπεριφορά πολυκρυσταλλικών δειγμάτων λυσοζύμης, μονοκλινούς και τετραγωνικής συμμετρίας, σε συνθήκες μεταβαλλόμενης σχετικής υγρασίας, μέσω πειραμάτων XRPD, με τη χρήση δεδομένων περίθλασης που καταγράφονται σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια αφυδάτωσης ή ενυδάτωσης του πολυκρυσταλλικού υλικού. Μέσω ανάλυσης Pawley στα δεδομένα εξάχθηκαν με ακρίβεια οι τιμές των πλεγματικών σταθερών, αποκαλύπτοντας μια χαρακτηριστική τάση εξέλιξης των τιμών τους συναρτήσει των υφιστάμενων περιβαλλοντικών μεταβολών. Επιπρόσθετα, εντοπίσθηκε το κατώτατο επίπεδο σχετικής υγρασίας στο οποίο διατηρείται η ακεραιότητα του κρυσταλλικού πλέγματος. Οι παρατηρήσεις αυτές, υπογραμμίζουν το εύρος των δυνατοτήτων των μετρήσεων ΧRPD, ως ένα ισχυρό εργαλείο καταγραφής των σταδιακών δομικών μεταβολών κατά τη μεταβολή των επιπέδων σχετικής υγρασίας με εφαρμογές στις διαδικασίες σχεδιασμού και παραγωγής φαρμακευτικών σκευασμάτων βασισμένων σε μικροκρυστάλλους πρωτεϊνών.
Οι πολυφαινολοξειδάσες (PPOs) είναι μια ομάδα ενζύμων που φέρουν χαλκό στο ενεργό τους κέντρο και χρησιμοποιούνται ως βιοκαταλύτες σε πολυάριθμες βιοχημικές αντιδράσεις με εφαρμογές στη Βιομηχανία Τροφίμων, Φαρμάκων και Καλλυντικών. Μία από τις πιο σημαντικές, αν και λιγότερο μελετημένες εφαρμογές των PPOs, είναι πως αποτελούν έναν εξαιρετικά ευαίσθητο ανιχνευτή παραγώγων φαινόλης (όπως οι χλωροφαινόλες, CPs) σε μολυσμένα νερά, ενώ τα ίδια μόρια (PPOs) αποτελούν αποτελεσματικά εργαλεία για τη βιοαποικοδόμηση των ουσιών αυτών. Το κεφάλαιο 11 της παρούσας διατριβής επικεντρώνεται στην κρυσταλλογραφική μελέτη των χαρακτηριστικών της πολυφαινολοξειδάσης προερχόμενης από τον θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophila, TtPPO. Σημειακές μεταλλάξεις οδήγησαν στην παραγωγή μεταλλαγμάτων με τροποποιημένη ενεργότητα έναντι των χλωροφαινολών. Το κεφάλαιο αυτό επικεντρώνεται στο δομικό χαρακτηρισμό του μεταλλάγματος G292N, απουσία και παρουσία υποστρώματος στοχεύοντας στη βαθύτερη κατανόηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας. Πληροφορίες που σχετίζονται με την πρόσδεση διαφορετικών υποστρωμάτων στο ενεργό κέντρο του ενζύμου όπως η καταγραφή των αμινοξέων που συμμετέχουν στη διαδικασία αυτή, που μπορούν να εξαχθούν από υψηλής ποιότητας δομικά μοντέλα, μπορούν να οδηγήσουν στο σχεδιασμό και παραγωγή ακόμα πιο αποδοτικών καταλυτών για τη βιοαποικοδόμηση χλωροφαινολών, παρέχοντας ένα οικονομικό, αποδοτικό και βιώσιμο εργαλείο για τη διαχείριση υδατικών λυμάτων.
Η συλλογή δεδομένων XRPD πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ποικιλία εξοπλισμού και οργάνων και παρουσιάζεται μια συστηματική σύγκριση των δεδομένων που συλλέχθηκαν. Εργαστηριακά περιθλασίμετρα χρησιμοποιήθηκαν συστηματικά τόσο κατά τα πειράματα διαβάθμισης σχετικής υγρασίας όσο και για τον πρωταρχικό έλεγχο πολυκρυσταλλικών δειγμάτων πριν τη συλλογή υψηλής ευκρίνειας δεδομένων περίθλασης στον ερευνητικό σταθμό ID22 του Ευρωπαϊκού Σύγχροτρον ESRF. Επιπρόσθετες μετρήσεις για τα πιο αντιπροσωπευτικά δείγματα πραγματοποιήθηκαν και στον ερευνητικό σταθμό X04SA του Ελβετικού Σύγχροτρον (SLS), με τη χρήση του ανιχνευτή MYTHEN II, που επέτρεψε την ανίχνευση μικρών, προηγουμένως μη ανιχνεύσιμων προσμίξεων και βελτίωσε δραματικά την ευκρίνεια των δεδομένων περίθλασης ακόμα και σε δείγματα χαμηλής κρυσταλλικότητας. Τέλος, τα πειράματα περίθλασης από μονοκρύσταλλο πραγματοποιήθηκαν κυρίως στους ερευνητικούς σταθμούς κρυσταλλογραφίας μακρομορίων (14.1 - 14.2 & P14) του Σύγχροτρον BESSY II στο Ινστιτούτο Helmholtz του Βερολίνου και του Γερμανικού Σύγχροτρον (DESY), αντίστοιχα.
Το σύνολο των αποτελεσμάτων και παρατηρήσεων της παρούσας διατριβής υπογραμμίζουν την αποτελεσματικότητα της συνδυαστικής χρήσης διαφορετικών τεχνικών περίθλασης ακτίνων-Χ, για τη συστηματική μελέτη της δομικής συμπεριφοράς μακρομορίων, σε ένα ευρύ φάσμα συνθηκών, παρέχοντας σε μικρό χρόνο ουσιαστική πληροφορία. |
| author2 |
Valmas, Alexandros |
| author_facet |
Valmas, Alexandros Βαλμάς, Αλέξανδρος |
| author |
Βαλμάς, Αλέξανδρος |
| author_sort |
Βαλμάς, Αλέξανδρος |
| title |
Συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος |
| title_short |
Συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος |
| title_full |
Συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος |
| title_fullStr |
Συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος |
| title_full_unstemmed |
Συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος |
| title_sort |
συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος |
| publishDate |
2021 |
| url |
http://hdl.handle.net/10889/15630 |
| work_keys_str_mv |
AT balmasalexandros syndyastikēchrēsētechnikōnaktinōnchgiatodomikocharaktērismobiologikōnmakromoriōnpharmakeutikouendiapherontos AT balmasalexandros combinationaluseofxraytechniquesforstructuralcharacterizationofbiologicalmacromoleculesofpharmaceuticalinterest |
| _version_ |
1771297307120107520 |
| spelling |
nemertes-10889-156302022-09-05T20:15:48Z Συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος Combinational use of X-ray techniques for structural characterization of biological macromolecules of pharmaceutical interest Βαλμάς, Αλέξανδρος Valmas, Alexandros Κρυσταλλογραφία Δομική βιολογία Βιοχημεία Ακτινοβολία σύγχροτρον Ιικές πρωτεΐνες Ινσουλίνη Σχετική υγρασία Πολυφαινολοξειδάσες Διαβήτης Δάγκειος ιός Ιός κοξάκι Σχεδιασμός φαρμάκων Crystallography Structural biology Biochemistry Synchrotron radiation Virus proteins Insulin Relative humidity Polyphenol oxidases Diabetes Dengue virus Coxsackie virus Drug design Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη συνδυαστική χρήση τεχνικών ακτίνων-Χ για το δομικό χαρακτηρισμό πρωτεϊνών φαρμακευτικού (ινσουλίνη, ιικές πρωτεΐνες) και βιοτεχνολογικού (TtPPO πολυφαινολοξειδάση) ενδιαφέροντος, καθώς και στην ανάπτυξη πρωτοκόλλων για την αξιολόγηση της σταθερότητας μικροκρυστάλλων μακρομορίων σε μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες. Σχετικά με την ανθρώπινη ινσουλίνη, πραγματοποιήθηκε μια ενδελεχής μελέτη του πολυμορφισμού (κρυσταλλικού και μοριακού), παρουσία τριών οργανικών μορίων-προσδετών (4-ethylresorcinol, m-nitrophenol και p-coumaric acid), συναρτήσει του pH (8ο κεφάλαιο). Η δομική συμπεριφορά του μορίου καταγράφηκε τόσο μέσω πειραμάτων περίθλασης ακτίνων-Χ από πολυκρυσταλλικά υλικά (XRPD) όσο και με πειράματα περίθλασης από μονοκρύσταλλο (SCXD). Εντοπίσθηκαν τέσσερα πολύμορφα μονοκλινούς συμμετρίας, δύο εκ των οποίων δεν έχουν καταγραφεί έως τώρα ξανά βιβλιογραφικά, ενώ εξετάζονται επίσης οι μεταξύ τους μεταβάσεις κρυσταλλικών φάσεων. Ένα από τα νέα μονοκλινή πολύμορφα, χαρακτηρίζεται από το πυκνότερο έως τώρα καταγεγραμμένο πακετάρισμα μορίων ινσουλίνης (ανάμεσα στα γνωστά μονοκλινή πολύμορφα στο ίδιο space group), με την ιδιαίτερη μοριακή του δομή να αποσαφηνίζεται μέσω πειραμάτων SCXD, παρέχοντας πληροφορίες που μπορούν δυνητικά να έχουν ιδιαίτερο φαρμακευτικό ενδιαφέρον. Πρωτεϊνικά μόρια με κομβικό ρόλο κατά τη διάρκεια του ιικού κύκλου ζωής, έχουν χαρακτηριστεί ως στόχοι κατάλληλοι για την ανάπτυξη αντιικών σκευασμάτων. Στο 9ο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής αναλύεται η έκφραση, απομόνωση, κρυστάλλωση, δομικός χαρακτηρισμός καθώς και πρωταρχικά πειράματα εντοπισμού μορίων-αναστολέων (fragment screening) για δυο ιικές πρωτεΐνες: H πρωτεΐνη 3Cpro, η κύρια πρωτεάση του ιού Coxsackie B3, υπεύθυνου για πολυάριθμα περιστατικά μυοκαρδίτιδας παγκοσμίως, και της επικράτειας μεθυλτρανσφεράσης (MTase domain) της μη δομικής πρωτεΐνης 5 (NS5) του ορότυπου 3 του ιού Dengue. Πολυκρυσταλλικά δείγματα κατάλληλα για μετρήσεις XRPD παρήχθησαν και για τις δυο πρωτεΐνες, ενώ ακολούθησε ο πρωταρχικός δομικός χαρακτηρισμός των μικροκρυστάλλων στο επίπεδο της μοναδιαίας κυψελίδας. Για την περίπτωση της 3Cpro και με τη χρήση μονοκρυστάλλων, διεξήχθη, τέλος, ένα πλήρες πείραμα για τον εντοπισμό χημικών θραυσμάτων-δυνητικών αναστολέων (fragment screening) έναντι του συγκεκριμένου μορίου. Το 10ο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής ερευνά το πώς μεταβολές περιβαλλοντικών παραγόντων όπως η σχετική υγρασία (rH) επηρεάζουν την εσωτερική οργάνωση των πρωτεϊνικών κρυστάλλων, που αποτελούνται από υψηλό ποσοστό διαλύτη. Η αναδιοργάνωση των μορίων που παρατηρείται στις περιπτώσεις αυτές μπορεί να καταγραφεί σε διακριτά προφίλ περίθλασης. Στο κεφάλαιο αυτό καταγράφεται η συμπεριφορά πολυκρυσταλλικών δειγμάτων λυσοζύμης, μονοκλινούς και τετραγωνικής συμμετρίας, σε συνθήκες μεταβαλλόμενης σχετικής υγρασίας, μέσω πειραμάτων XRPD, με τη χρήση δεδομένων περίθλασης που καταγράφονται σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια αφυδάτωσης ή ενυδάτωσης του πολυκρυσταλλικού υλικού. Μέσω ανάλυσης Pawley στα δεδομένα εξάχθηκαν με ακρίβεια οι τιμές των πλεγματικών σταθερών, αποκαλύπτοντας μια χαρακτηριστική τάση εξέλιξης των τιμών τους συναρτήσει των υφιστάμενων περιβαλλοντικών μεταβολών. Επιπρόσθετα, εντοπίσθηκε το κατώτατο επίπεδο σχετικής υγρασίας στο οποίο διατηρείται η ακεραιότητα του κρυσταλλικού πλέγματος. Οι παρατηρήσεις αυτές, υπογραμμίζουν το εύρος των δυνατοτήτων των μετρήσεων ΧRPD, ως ένα ισχυρό εργαλείο καταγραφής των σταδιακών δομικών μεταβολών κατά τη μεταβολή των επιπέδων σχετικής υγρασίας με εφαρμογές στις διαδικασίες σχεδιασμού και παραγωγής φαρμακευτικών σκευασμάτων βασισμένων σε μικροκρυστάλλους πρωτεϊνών. Οι πολυφαινολοξειδάσες (PPOs) είναι μια ομάδα ενζύμων που φέρουν χαλκό στο ενεργό τους κέντρο και χρησιμοποιούνται ως βιοκαταλύτες σε πολυάριθμες βιοχημικές αντιδράσεις με εφαρμογές στη Βιομηχανία Τροφίμων, Φαρμάκων και Καλλυντικών. Μία από τις πιο σημαντικές, αν και λιγότερο μελετημένες εφαρμογές των PPOs, είναι πως αποτελούν έναν εξαιρετικά ευαίσθητο ανιχνευτή παραγώγων φαινόλης (όπως οι χλωροφαινόλες, CPs) σε μολυσμένα νερά, ενώ τα ίδια μόρια (PPOs) αποτελούν αποτελεσματικά εργαλεία για τη βιοαποικοδόμηση των ουσιών αυτών. Το κεφάλαιο 11 της παρούσας διατριβής επικεντρώνεται στην κρυσταλλογραφική μελέτη των χαρακτηριστικών της πολυφαινολοξειδάσης προερχόμενης από τον θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophila, TtPPO. Σημειακές μεταλλάξεις οδήγησαν στην παραγωγή μεταλλαγμάτων με τροποποιημένη ενεργότητα έναντι των χλωροφαινολών. Το κεφάλαιο αυτό επικεντρώνεται στο δομικό χαρακτηρισμό του μεταλλάγματος G292N, απουσία και παρουσία υποστρώματος στοχεύοντας στη βαθύτερη κατανόηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας. Πληροφορίες που σχετίζονται με την πρόσδεση διαφορετικών υποστρωμάτων στο ενεργό κέντρο του ενζύμου όπως η καταγραφή των αμινοξέων που συμμετέχουν στη διαδικασία αυτή, που μπορούν να εξαχθούν από υψηλής ποιότητας δομικά μοντέλα, μπορούν να οδηγήσουν στο σχεδιασμό και παραγωγή ακόμα πιο αποδοτικών καταλυτών για τη βιοαποικοδόμηση χλωροφαινολών, παρέχοντας ένα οικονομικό, αποδοτικό και βιώσιμο εργαλείο για τη διαχείριση υδατικών λυμάτων. Η συλλογή δεδομένων XRPD πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ποικιλία εξοπλισμού και οργάνων και παρουσιάζεται μια συστηματική σύγκριση των δεδομένων που συλλέχθηκαν. Εργαστηριακά περιθλασίμετρα χρησιμοποιήθηκαν συστηματικά τόσο κατά τα πειράματα διαβάθμισης σχετικής υγρασίας όσο και για τον πρωταρχικό έλεγχο πολυκρυσταλλικών δειγμάτων πριν τη συλλογή υψηλής ευκρίνειας δεδομένων περίθλασης στον ερευνητικό σταθμό ID22 του Ευρωπαϊκού Σύγχροτρον ESRF. Επιπρόσθετες μετρήσεις για τα πιο αντιπροσωπευτικά δείγματα πραγματοποιήθηκαν και στον ερευνητικό σταθμό X04SA του Ελβετικού Σύγχροτρον (SLS), με τη χρήση του ανιχνευτή MYTHEN II, που επέτρεψε την ανίχνευση μικρών, προηγουμένως μη ανιχνεύσιμων προσμίξεων και βελτίωσε δραματικά την ευκρίνεια των δεδομένων περίθλασης ακόμα και σε δείγματα χαμηλής κρυσταλλικότητας. Τέλος, τα πειράματα περίθλασης από μονοκρύσταλλο πραγματοποιήθηκαν κυρίως στους ερευνητικούς σταθμούς κρυσταλλογραφίας μακρομορίων (14.1 - 14.2 & P14) του Σύγχροτρον BESSY II στο Ινστιτούτο Helmholtz του Βερολίνου και του Γερμανικού Σύγχροτρον (DESY), αντίστοιχα. Το σύνολο των αποτελεσμάτων και παρατηρήσεων της παρούσας διατριβής υπογραμμίζουν την αποτελεσματικότητα της συνδυαστικής χρήσης διαφορετικών τεχνικών περίθλασης ακτίνων-Χ, για τη συστηματική μελέτη της δομικής συμπεριφοράς μακρομορίων, σε ένα ευρύ φάσμα συνθηκών, παρέχοντας σε μικρό χρόνο ουσιαστική πληροφορία. The present PhD thesis focuses on the combined use of X-ray methodologies for the structural characterization of proteins of pharmaceutical (insulin, virus proteins) and biotechnological (TtPPO polyphenol oxidase) interest, as well as the development of protocols for stability evaluation of macromolecular crystalline precipitates upon varying environmental conditions (relative humidity). With respect to human insulin (HI), a thorough examination of protein polymorphism (molecular and crystal) upon binding of the phenolic derivatives 4-ethylresorcinol, m-nitrophenol and p-coumaric acid over a wide pH range, was performed (8th chapter). The determination of HI’s structural behaviour via X-ray Powder Diffraction (XRPD) and Single-Crystal X-ray Diffraction (SCXRD), is reported. Four distinct polymorphs of monoclinic symmetry were identified, two of which have not been reported previously. Intermediate phase transitions are also discussed. One of the novel monoclinic polymorphs displays the highest molecular packing among insulin polymorphs of the same space group to date, while its structure was elucidated by SCXRD. These observation could be of great pharmacological interest. Proteins that orchestrate the assembly of viral components during viral life cycle and proliferation have been considered as possible antiviral targets. In the 9th chapter of the PhD thesis, the expression, purification, crystallization, X-ray diffraction analysis as well as preliminary fragment screening experiments are presented for two proteins: the3Cpro, the main protease of an emerging enterovirus, coxsackievirus B3, which is responsible for many cases of viral myocarditis and NS5 MTase domain of Dengue virus 3, infections of which often provoke life-threatening diseases of epidemic magnitudes. Polycrystalline precipitates suitable for XRPD measurements were produced for both proteins and preliminary structural characterization (lattice parameters, symmetry, space group) was also achieved. In the case of 3Cpro, a crystallographic fragment screening campaign was conducted towards identification of potential binding of small organic molecules (fragments) to protein targets. Variation of relative humidity (rH) greatly affects the internal order of solvent-based protein crystals, and the rearrangement of molecules can be efficiently recorded in distinct diffraction patterns. The 10th chapter of this thesis focuses on this topic, reporting the effect of rH variation experiments on hen egg white lysozyme (HEWL) polycrystalline precipitates of monoclinic and tetragonal symmetry using XRPD. In situ XRPD data were collected on HEWL specimens during dehydration and rehydration processes using laboratory instrumentation. Pawley analysis of collected data sets and accurate extraction of unit cell parameters indicated a characteristic evolution of the lattice /unit cell parameters with rH in both cases. In addition, the lowest humidity level below which samples do not retain their crystallinity was (also) identified. This work illustrates the accuracy of (laboratory) XRPD data as a probe for in situ investigations of gradual structural modifications upon rH variation, providing essential information for improving production and post-production practices of microcrystalline protein-based pharmaceuticals. Polyphenol oxidases (PPOs) are a group of Cu/copper-containing enzymes which have been widely employed as biocatalysts with a vast spectrum of applications in food, pharmaceutical, and cosmetic industries. One of the most important, although least studied, application of PPOs is as sensitive detectors of phenol derivatives (such as chlorophenols, CPs) in polluted waters, as well as efficient tools towards biodegradation of these substances. Chapter 11 focuses on structural studies of a specific PPO from the thermophilic fungus Thermothelomyces thermophila (TtPPO). Point mutations were designed, that led to TtPPO variants with altered activity against CPs. The structural characterization of a specific TtPPO mutant (G292N) is reported herein, in the presence or absence of its substrates, in order to shed light on the structure-function relations that determine its specificity. Observations concerning the binding of the different substrates to the active site of the enzyme, i.e. the identification of the amino acids involved in this process, extracted form high-resolution structural models, would allow for structure-based design and production of a more potent biocatalyst for the bioremediation of CPs, providing an economic, effective and sustainable tool for wastewater treatment. XRPD data collection was performed using a variety of instrumental setups and a systematic comparison of the acquired data is presented. A laboratory diffractometer was used for screening prior to high-resolution XRPD data collection at the ID22 beamline at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Additional measurements for the most representative samples were performed at the X04SA beamline at the Swiss Light Source (SLS), using the MYTHEN II detector, which allowed for the detection of minor, previously untraceable impurities and significantly improved the d-spacing resolution even for poorly diffracting samples. Single crystal diffraction experiments were mainly performed at the macromolecular crystallography beamlines (14.1 & 14.2) of BESSY II at Helmholtz Institute Berlin. The aforementioned observation demonstrate the applicability and efficacy of the synergistic use of single-crystal and powder X-ray diffraction for the systematic screening of crystallization conditions for a wide spectrum of macromolecules, an approach providing accurate structural information. 2021-11-22T06:30:28Z 2021-11-22T06:30:28Z 2020-10-23 http://hdl.handle.net/10889/15630 gr application/pdf |
