| Περίληψη: | Η διάκριση της αλυσίδας poly-ADP-ribose (PAR) από την αλυσίδα poly-adenine πριν περίπου 50 χρόνια, καθώς και η διερεύνηση της ADP-ριβοζυλίωσης ως αναστρέψιμης μετα-μεταφραστικής τροποποίησης, τα τελευταία 20 χρόνια, οδήγησε στην εμφάνιση νέων προοπτικών στη μελέτη διάφορων κυτταρικών διαδικασιών εστιάζοντας αρχικά στην επιδιόρθωση του DNA και στην οργάνωση της χρωματίνης και συνεχίζοντας προς το πεδίο του οξειδωτικού στρες και της ανοσολογικής απόκρισης. Η οικογένεια των πρωτεϊνών PARP αποτελείται από 17 μέλη και είναι η κύρια υπεύθυνη για την παρουσία αυτής της τροποποίησης στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Οι PARPs αποτελούνται από μία συντηρημένη καταλυτική επικράτεια η οποία είναι υπεύθυνη για τον καταβολισμό του μορίου NAD+ σε ADP-r και ΝΑΜ και συνήθως τη μεταφορά μίας μονάδας ADP-r ή μιας αλυσίδας ADP-r (PAR) σε ένα υπόστρωμα. Ωστόσο αυτό που προσδίδει τη μοναδική λειτουργία και σημασία του κάθε πρωτεϊνικού μέλους στις κυτταρικές διαδικασίες είναι οι υπόλοιπες επικράτειες τους. Μία οικογένεια επικρατειών η οποία φαίνεται να είναι εξελικτικά συντηρημένη σε όλα τα βασίλεια ζωής και είναι μέρος τριών PARP, οι οποίες ονομάζονται macroPARPs, είναι η οικογένεια macro. Οι macroPARPs (PARP9/14/15) διαθέτουν πολλαπλές διαδοχικές macro επικράτειες οι οποίες δύναται να αναγνωρίζουν διαφορετικά προϊόντα της ADP-ριβοζυλίωσης. Η ανθρώπινη PARP9 (hPARP9) εντοπίζεται φυσιολογικά σε όλους τους ιστούς, συμμετέχει στην επιδιόρθωση του DNA, ενώ σε παθολογικές καταστάσεις υπερ-εκφράζεται σε χημειοανθεκτικούς καρκίνους και σε καρδιαγγειακές παθήσεις. Επιπλέον, η έκφρασή της επάγεται από την IFN-γ κατά τη λοίμωξη από παθογόνα. Σκοπός της συγκεκριμένης μεταπτυχιακής εργασίας είναι η μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας της πρωτεϊνικής επικράτειας macro2 (MD2) της hPARP9 με τον φυσικό της προσδέτη ADP-r μέσω φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy-NMR spectroscopy) σε διάλυμα, ώστε να αντληθούν πληροφορίες για την αποσαφήνιση του μηχανισμού πρόσδεσης του μικρού μορίου σε ατομικό επίπεδο. Αυτές θα συνεισφέρουν στη διαλεύκανση της λειτουργίας της σε φυσιολογικές αλλά και παθολογικές καταστάσεις. Το τμήμα DNA το οποίο κωδικοποιεί την hPARP9MD2 κλωνοποιήθηκε επιτυχώς σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης pET28a(+). H hPARP9MD2 εκφράστηκε μέσω χρήσης του ετερόλογου βακτηριακού συστήματος EXPRESS BL21 (DE3) E.coli. Το πολυπεπτίδιο επισημάνθηκε καθολικά με τα ισότοπα των πυρήνων 15Ν ή/ και 13C σύμφωνα με τις εκάστοτε απαιτήσεις του πειράματος NMR. Η hPARP9MD2 απομονώθηκε σε υψηλή καθαρότητα με απόδοση 2,1 mg/L βακτηριακής καλλιέργειας (σε θρεπτικό υλικό ελαχίστων μέσων). Οι μελέτες σταθερότητας της επικράτειας απέδειξαν ότι η δέσμευση του μορίου ADP-r αυξάνει την σταθερότητά της. Η τιτλοδότηση της hPARP9MD2 με το χημικό μόριο ADP-r παρακολουθήθηκε μέσω φασματοσκοπίας NMR και παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση. Πειράματα NMR διεξήχθησαν στο σύμπλοκο της hPARP9MD2 με το ADP-r. Τα δεδομένα από την ανάλυση των πειραμάτων NMR μέχρι στιγμής υποδεικνύουν ένα αναδιπλωμένο πρωτεϊνικό μόριο είτε βρίσκεται στην ελεύθερη είτε στην δεσμευμένη μορφή του. Η ταυτοποίηση των ατόμων του πολυπεπτιδικού σκελετού πραγματοποιήθηκε σε ποσοστό 73 % (λόγω αλληλοεπικάλυψης σημάτων και παρουσίας ευκίνητων περιοχών). Τα προβλεπόμενα δευτεροταγή στοιχεία της hPARP9MD2, μετά την εισαγωγή των χημικών μετατοπίσεων των ατόμων στο διαδικτυακό πρόγραμμα TALOS, αποκαλύπτουν μια «ββαβααββαβαβα» τοπολογία ταυτόσημη με την ελεύθερη κρυσταλλική της δομή. Η ανάλυση των υπολοίπων τριπυρηνικών πειραμάτων και των πειραμάτων δυναμικής θα επιδείξει την ακριβή περιοχή πρόσδεσης και θα συνεισφέρει στη διερεύνηση της δυναμικής συμπεριφοράς του πολυπεπτιδίου κατά την δέσμευση του μικρού μορίου.
|
|---|
